方立超,程 平,賀 娟,李 艷,黃 輝,鄧 均,蔣麗莉,楊 帆,邱宗文,鄭峻松△

(第三軍醫(yī)大學(xué):1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系既藥學(xué)院臨床檢驗(yàn)學(xué)教研室;2.西南醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.新橋醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶400038)

近年來肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染有明顯增加的趨勢,并且成為革蘭陰性桿菌和醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一。由于各種抗菌藥物的廣泛使用導(dǎo)致K.pneumoniae對以β-內(nèi)酰胺類抗生素為主的多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性,?？梢砸鸶鞣N難治性感染。越來越多的證據(jù)表明,菌毛在該菌致病過程中發(fā)揮了重要作用,與細(xì)菌的黏附定植相關(guān)。細(xì)菌可借助于菌毛尖端的黏附素對宿主黏膜上皮細(xì)胞的黏附作用黏附到宿主組織器官,通過這種黏附,細(xì)菌得以定居,從而獲得侵襲的通道,這是機(jī)體致病的首要條件[1]。該菌有兩類菌毛,即Ⅰ型和Ⅲ型菌毛。Ⅰ型菌毛屬于甘露糖敏感性(mannose-sensitive)菌毛,即在甘露糖存在時(shí)會阻斷菌毛與紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象,主要黏附在尿道上皮細(xì)胞;Ⅲ型菌毛具有甘露糖抵抗血凝特性(MRHA),故又稱為甘露糖抵抗血凝特性菌毛,主要黏附在呼吸道上皮細(xì)胞[2]。

為了探討醫(yī)院內(nèi)K.pneumoniae感染發(fā)病情況、菌種分布特點(diǎn),指導(dǎo)臨床診治、控制醫(yī)院感染以及進(jìn)行流行病學(xué)研究,2007年7月至2008年7月共收集了重慶兩家三甲醫(yī)院(新橋醫(yī)院和西南醫(yī)院)檢驗(yàn)科細(xì)菌室158株K.pneumoniae,并運(yùn)用PCR方法、血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)對收集菌株產(chǎn)生Ⅰ型、Ⅲ型菌毛的情況進(jìn)行了分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2007年7月至2008年7月分別從西南醫(yī)院和新橋醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室收集K.pneumoniae共計(jì)158株,其中痰液138株,皮下積液7株,腦脊液5株,傷口分泌物8株。

1.2 試劑 D-甘露糖為上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)品,Taq DNA聚合酶和Genomic DNA kit為天根生物產(chǎn)品,DL2000 marker為Takara產(chǎn)品。改良 Minka培養(yǎng)基:酪蛋白胨 5.00 g,酵母浸粉1.00 g,KH2PO41.36 g,Na2HPO48.00 g,甘油 5.00 m L,微量鹽溶液1.00 mL,蒸餾水定容至1 000 mL,p H7.0～7.2。微量鹽溶液配方:MgSO4.2H 2 O 10 g,MnCl2.4H 2 O 1 g,FeCl2.6H2O 0.135 g,CaCl2.2H2O 0.4 g,定容至1 L,2～8℃保存。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將各菌株分別經(jīng)改良Minka液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)48 h,同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代3次,即為菌毛化菌體[3]。

1.4 模板DNA的制備 各株菌經(jīng)培養(yǎng)后,用基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組,作為擴(kuò)增菌毛主要結(jié)構(gòu)基因的DNA模板。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 針對Ⅰ型和Ⅲ型菌毛各設(shè)計(jì)1對引物[3],由上海英俊公司合成。兩對引物序列如下,Ⅰ型(擴(kuò)增長度 549bp)上游引物:5′-ACG CGT CGA CAT GAT GAA AAAAAT AAT CCCCCT G-3′,下游引物 :5′-CCG CTC GAG CTA TCCCCT GCG CCG GCG AG-3′;Ⅲ型(擴(kuò)增長度 609bp)上游引物 :5′-CCG CTC GAG TTA CTG ATA AGT AAT TTC GTA AG-3′,下 游引物:5′-CGC GGA TCC ATG AAA AAG GTT CTT CTC TCT G-3′。

表1 K.pneumoniaⅠ、Ⅲ型菌毛分析結(jié)果〔株(%)〕

1.6 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系:模板 DNA各 1μL,正反向引物各1μL,2Master Mix 12.5μL,ddH2O 9.5μL(體系為25 μL)。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5 min,94℃45 s,60℃60 s,72℃60 s,29個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,電壓120 V,電泳時(shí)間20 min。

1.7 血凝/血凝抑制實(shí)驗(yàn)[4]采健康豚鼠血,分離紅細(xì)胞,用PBS制成2%紅細(xì)胞懸液。菌株經(jīng)改良Minka液體培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代至第3代,制成約50×109cfu/m L細(xì)菌懸液,每株菌分為兩個(gè)樣本,一個(gè)不加D-甘露糖,另一個(gè)加D-甘露糖至終濃度為0.5%,比較D-甘露糖對血凝反應(yīng)的抑制作用。首先在96孔V型板中加入上述制備的各2個(gè)供試樣本的菌懸液30μL,同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對照(觀察有無自凝現(xiàn)象);再加入等量(預(yù)冷)的2%豚鼠紅細(xì)胞懸液,在微量振蕩器上混勻 30～60 s,置4℃1～2 h,觀察血凝反應(yīng)和D-甘露糖是否抑制凝集;最后取甘露糖抵抗血凝試驗(yàn)陽性的菌株,待4℃下完全凝集后,置37℃恒溫箱中30 min,檢查凝集現(xiàn)象是否被解脫。待凝集解脫后,重新混勻,置4℃1 h,觀察是否再現(xiàn)凝集反應(yīng)。若供試菌株對豚鼠紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)不能抵抗D-甘露糖的抑制作用,該菌株產(chǎn)生的是Ⅰ型菌毛抗原;如果供試菌株對豚鼠紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)能夠抵抗D-甘露糖的抑制作用,37℃出現(xiàn)解脫,4℃又重現(xiàn)凝集反應(yīng),即判定為MRHA陽性菌株,該菌株能夠產(chǎn)生Ⅲ型菌毛抗原。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,158株供試菌株中,有7株菌針對Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位基因(fimA)序列的引物擴(kuò)增出549 bp目的片段,145株菌針對Ⅲ型菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因(mrk A)序列的引物擴(kuò)增出609 bp的目的片段,與預(yù)期的大小完全相符,2株菌既擴(kuò)增出了fimA又?jǐn)U增出了mrkA目的片段,還有6株菌未擴(kuò)增出fimA或mrk A目的片段(表1),部分菌株 PCR擴(kuò)增結(jié)果,見圖1、2。

圖1 fimA擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 血凝實(shí)驗(yàn)/血凝抑制實(shí)驗(yàn) 158株供試細(xì)菌中,除11株外,其余147株均能凝集2%的豚鼠紅細(xì)胞,有7株不能抵抗D-甘露糖的抑制作用,140株能抵抗D-甘露糖的抑制作用,且抗D-甘露糖血凝反應(yīng)在37℃下均能被解脫,在4℃下重現(xiàn)完全凝集,符合陽性判定標(biāo)準(zhǔn),即能夠產(chǎn)生Ⅲ型菌毛,陰性對照組無自凝現(xiàn)象。

圖2 mrk A擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討 論

158株供試菌株中,145株擴(kuò)增出了mrk A目的片段,其中7株擴(kuò)增出了fimA目的片段,其中2株擴(kuò)增出前述兩個(gè)目的片段,另6株菌未擴(kuò)增出前述目的片段,這些擴(kuò)增出目的片段的菌株,有5株菌無血凝特性。何禮洋等[3]報(bào)道用PCR方法鑒定K.pneumoniaeⅠ型、Ⅲ型菌毛,較之血凝實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)敏感。其原因?yàn)?(1)菌毛表達(dá)與否和培養(yǎng)條件關(guān)系密切;(2)與菌毛的血凝譜有一定關(guān)系。有的菌毛可凝集人、豬、羊、豚鼠及雞等動(dòng)物的紅細(xì)胞,而有的菌毛只凝集豬及雞等少數(shù)動(dòng)物的紅細(xì)胞,所以即使有菌毛,也不一定能根據(jù)血凝特性劃分類型。此外,還可因出現(xiàn)紅細(xì)胞非特異性凝集而產(chǎn)生假陽性。在K.pneumoniae所屬的Ⅰ型及Ⅲ型菌毛中,Ⅰ型菌毛能與近曲小管細(xì)胞和尿中可溶性含甘露糖蛋白結(jié)合,表明Ⅰ型菌毛介導(dǎo)泌尿生殖道的細(xì)菌移植[4]。表達(dá)有Ⅲ型菌毛的K.pneumoniae能黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和呼吸道、泌尿生殖道的上皮細(xì)胞上,在腎臟Ⅲ型菌毛能介導(dǎo)細(xì)菌黏附到腎小管基底膜、Bowman囊和腎小管上[5]。本實(shí)驗(yàn)說明供試菌株多數(shù)是產(chǎn)生Ⅲ型菌毛的,且多數(shù)是來于痰液標(biāo)本,大多數(shù)產(chǎn)生Ⅲ型菌毛的菌株主要造成呼吸道感染。

臨床研究分析表明,K.pneumoniae分布廣泛,在痰及咽拭物、膿汁、尿、血、腦脊液、腹腔液、膽汁、白帶、前列腺液、骨髓液、眼分泌液都可分離到產(chǎn)ESBLS的克雷伯菌。K.pneumoniae是目前革蘭陰性菌中除大腸桿菌外重要的條件致病菌。已成為醫(yī)院感染的高危菌[6]。近年來K.pneumoniae耐藥率顯著增高,尤其是產(chǎn)ESBLs菌株明顯增加,直接導(dǎo)致老年患者肺炎死亡率增高[7]。由于K.pneumoniae對以β-內(nèi)酰胺類抗生素為主的多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性,使得醫(yī)院K.pneumoniae感染的控制成為燙手山芋[8]。就醫(yī)院感染K.pneumoniae菌毛類型的分類,對研究人K.pneumoniae的致病機(jī)制及診斷與防治均有重要意義。這兩家三甲醫(yī)院分布的K.pneumoniae主要是產(chǎn)生Ⅲ型菌毛的菌株,主要是造成呼吸道感染,這對于尋求抗生素替代療法,研發(fā)針對性的疫苗和藥品無疑具有指導(dǎo)意義。

(志謝:感謝吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院韓文瑜老師提供改良Minka液體培養(yǎng)基配方。)

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