鄧力為 倪健 沈小春

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

復(fù)方咳喘消顆粒由辛夷、金銀花、烏梅、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮等藥味組成，主要用于急、慢性支氣管炎(包括慢支急性發(fā)作)，喘息性氣管炎等的治療。其制備工藝包括醇提、水提兩部分，君藥為辛夷、金銀花。該顆粒劑處方藥味較多，藥量大，而原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅針對(duì)兩味君藥的指標(biāo)性成分進(jìn)行定性、定量分析，難以控制方劑的整體物質(zhì)群，無法保證制劑的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)復(fù)方咳喘消顆粒指紋圖譜進(jìn)行研究，以期完善復(fù)方咳喘消顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)對(duì)顆粒劑、中間提取物（醇提、水提）及處方中的藥材指紋圖譜進(jìn)行對(duì)照分析，闡明顆粒劑指紋圖譜共有峰的來源，為復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Aglient 1100高效液相色譜儀（在線真空脫機(jī)，四元梯度泵，手動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器）；Hamilton進(jìn)樣針（25μL）；BP211D 電子天平（德國(guó)賽多利斯）；CX-300超聲波清洗機(jī)（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）。

復(fù)方咳喘消顆粒 （批號(hào)為 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中醫(yī)藥大學(xué)GMP車間提供；水提浸膏、醇提浸膏（批號(hào)為 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中醫(yī)藥大學(xué) GMP車間提供；辛夷、金銀花、烏梅、紫菀、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮藥材，購(gòu)自安國(guó)以嶺中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定各藥均需符合中國(guó)藥典2005年版一部項(xiàng)下的有關(guān)要求。

木蘭脂素對(duì)照品（批號(hào)：882-200102）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413）、五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-200406）、秦皮甲素對(duì)照品（111731-200501）、秦皮乙素對(duì)照品（110741-200506），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

乙腈（Fisher公司，色譜純），屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

色譜柱：依利特 Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL，梯度洗脫條件見2.6.2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取木蘭脂素、綠原酸、五味子醇甲、秦皮甲素、秦皮乙素對(duì)照品適量，用甲醇溶液分別制備成0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.3 樣品溶液的制備

取顆粒劑4.0 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 水提（醇提）浸膏溶液的制備

精密稱取水提（醇提）浸膏1.0 g，精密加入甲醇20 mL，按樣品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 藥材溶液的制備

精密稱取辛夷、金銀花、烏梅、紫菀、五味子、北葶藶子、鉤藤、半夏、瓦楞子、秦皮藥材適量，精密加入甲醇20 mL，按樣品溶液的制備方法制備，即得。

2.6 色譜分離條件優(yōu)化

2.6.1 流動(dòng)相系統(tǒng)選擇 比較了流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)分離效果更好，且柱壓較低，選擇乙腈-水系統(tǒng)，并對(duì)其進(jìn)行梯度優(yōu)化。

2.6.2 梯度優(yōu)化 以HPLC指紋圖譜中各峰的分離度為優(yōu)化指標(biāo)，最終確定如下所示的梯度條件：0 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（5%∶95%）；34 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（10%∶90%）；65 min，乙腈 -0.2%磷酸水溶液（25%∶75%）；79 min，乙腈-0.2%磷酸溶液（45%∶55%）；95 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（53%∶47%）；100 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（5%∶95%）。

2.6.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 在 365 nm、300 nm、280 nm、260 nm、240 nm、210 nm波長(zhǎng)下，按照2.1色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖1。

圖1 復(fù)方咳喘消顆粒指紋圖譜波長(zhǎng)選擇

由圖可見，240 nm下全方中的指紋峰的峰數(shù)和峰強(qiáng)度均優(yōu)于其他波長(zhǎng)，因此選擇240 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.6.4 流動(dòng)相選擇 考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.15%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%磷酸對(duì)指紋圖譜中色譜峰分離的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 復(fù)方咳喘消顆粒指紋圖譜流動(dòng)相選擇

由圖可見，以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相，幾個(gè)關(guān)鍵色譜峰得以分離，峰形得到改善。結(jié)果還表明，0.2%和0.3%磷酸對(duì)圖譜的影響不大，考慮到酸度較大，會(huì)影響色譜柱壽命，最終選用乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相。

2.6.5 溶劑選擇 分別以甲醇、無水乙醇、60%乙醇作為提取溶劑制備樣品，考察對(duì)所得指紋圖譜峰數(shù)及峰形的影響。結(jié)果顯示：三者作為溶劑制備樣品，對(duì)指紋圖譜各峰的影響很小，故選擇黏度最低的甲醇作為溶劑。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)070815）連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得指紋圖譜共有峰45個(gè)，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方咳喘消顆粒（批號(hào)070815）各6份進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)070815）分別在0、6、12、24、36、48 h 進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.8.1 指紋圖譜 采用“2.1測(cè)定條件”項(xiàng)下方法測(cè)定10批樣品，得到指紋圖譜，見圖3。根據(jù)10批樣品指紋圖譜提供的各種相關(guān)參數(shù)，確認(rèn)樣品中所有化學(xué)成分的色譜峰在100 min內(nèi)全部出完。

2.8.2 共有指紋峰的標(biāo)定及其峰形與峰貌描述 比較上述各色譜峰，發(fā)現(xiàn)在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，有45個(gè)峰或峰組是共有的，確認(rèn)為共有指紋峰。

圖3 復(fù)方咳喘消顆粒HPLC指紋圖譜

2.8.3 共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值 在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，以峰面積較大、分離度好、保留時(shí)間近中間的18號(hào)峰為參照峰，以其保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算其他各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值（峰面積比值計(jì)算時(shí)，僅限于峰面積占總峰面積大于2%者），得到樣品的指紋圖譜的相關(guān)技術(shù)參數(shù)，結(jié)果見表1。各特征指紋峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間均具有較好的重現(xiàn)性，特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%。

2.8.4 相似度計(jì)算 使用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，將1～10批次咳喘消顆粒圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入，經(jīng)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜。10批復(fù)方咳喘消顆粒的相似度分別為0.992、0.973、0.969、0.972、0.984、0.984、0.981、0.985、0.973、0.990，具有較好的相關(guān)性，見圖4。

表1 各共有峰的相關(guān)參數(shù)

2.9 指紋圖譜少量色譜峰的指認(rèn)

分別吸取一定量2.2制備的對(duì)照品溶液加入到樣品溶液中，按照“2.1測(cè)定條件”項(xiàng)下方法測(cè)定指紋圖譜，與未加對(duì)照品溶液的樣品指紋圖譜進(jìn)行比較，通過色譜峰峰高或峰面積的增加，對(duì)指紋圖譜共有化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn)，其中6號(hào)峰為秦皮甲素、10號(hào)峰為秦皮乙素、11號(hào)峰為綠原酸、37號(hào)峰為木蘭脂素、39號(hào)峰為五味子醇甲。

圖4 復(fù)方咳喘消顆粒指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

2.10 指紋圖譜共有指紋峰與相應(yīng)提取部位指紋圖譜的相關(guān)性

分別取2.4制備的水提（醇提）浸膏溶液（批號(hào)為061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），按照“2.1 測(cè)定條件”項(xiàng)下方法測(cè)定，得各提取部位指紋圖譜，并與樣品指紋圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5、圖6。

圖6 復(fù)方咳喘消顆粒水提部位HPLC指紋圖譜

由圖可知，水提部位指紋峰多集中于指紋圖譜0～80 min段，而醇提部位指紋峰多集中于指紋圖譜80～100 min段，水提物質(zhì)極性較大先出峰，且說明處方中水提物質(zhì)比重較大。

2.11 指紋圖譜共有指紋峰與處方藥材相應(yīng)部位指紋圖譜的相關(guān)性

分別取2.5制備的藥材溶液，按照“2.1測(cè)定條件”項(xiàng)下方法測(cè)定，得到處方中各藥材指紋圖譜。見圖7。

將各藥材圖譜與樣品指紋圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)對(duì)各色譜峰的保留時(shí)間、峰形等的考察，對(duì)指紋圖譜共有指紋峰與處方藥材相應(yīng)部位指紋圖譜的相關(guān)性進(jìn)行分析確認(rèn)。結(jié)果見表2。

3 討論

圖7 復(fù)方咳喘消復(fù)方各藥材HPLC指紋圖譜

表2 指紋圖譜共有色譜峰來源

3.1 復(fù)方咳喘消顆粒為復(fù)方制劑，成分較多，未對(duì)各色譜峰化學(xué)成分一一歸屬確認(rèn)，僅給出6號(hào)峰（秦皮甲素）、10號(hào)峰（秦皮乙素）、11號(hào)峰（綠原酸）、37號(hào)峰（木蘭脂素）、39號(hào)峰（五味子醇甲）的歸屬。

由歸屬分析可得出各色譜峰的藥材來源，處方中十味藥材均對(duì)復(fù)方有所貢獻(xiàn)，并有一個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)兩種或者三種藥材歸屬的情況。君藥金銀花對(duì)應(yīng)13組色譜峰，辛夷對(duì)應(yīng)14組色譜峰，亦說明君藥在處方中比重較大，具備相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)建立了顆粒醇提部位及水提部位的指紋圖譜，也對(duì)中間提取物的質(zhì)量起到一定控制作用[1]。

3.2 用于判斷復(fù)方咳喘消顆粒質(zhì)量穩(wěn)定性時(shí)，一方面通過圖譜的直觀比較，能夠反映出各共有峰的有無及大致比例，從而判斷其質(zhì)量一致性的情況；另一方面通過計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，判斷是否符合所建立的指紋圖譜的技術(shù)參數(shù)[2-3]。另外可通過峰面積對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行定量，同時(shí)，采用藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，相關(guān)系數(shù)不得低于0.90，以此制定復(fù)方咳喘消顆粒真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 指紋圖譜與中藥有效成分的復(fù)雜性、不確知性，以及發(fā)揮作用時(shí)眾多成分的協(xié)同性、多靶點(diǎn)性特點(diǎn)相吻合[4]。復(fù)方咳喘消顆粒的HPLC指紋圖譜，可作為控制其質(zhì)量的定性指標(biāo)，為處方中各味藥材發(fā)揮臨床療效提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)保障。

[1]王新宏,安睿.數(shù)字化色譜指紋圖譜技術(shù)在雙黃連制劑質(zhì)量及藥材鑒定中的應(yīng)用[J].中草藥,2002,33（2）：115-118.

[2]沙明,曹愛民.HPLC指紋圖譜技術(shù)在中藥新藥質(zhì)量控制的應(yīng)用[J].中草藥,2002,33(2):181-183.

[3]胡柳,欒連軍.復(fù)方有效部位與組方藥材指紋圖譜色譜峰相關(guān)性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004，39（12）：895-902.

[4]聶晶,田頌久,王國(guó)榮.中藥指紋圖譜的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)中藥雜志,2000,31(12):881-890.