蔡玉穎,劉志順,王 順,王奇峰,談太鵬,蔣 花
(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 針灸科,北京 100053;2.黑龍江省中醫(yī)研究院 針灸科,黑龍江 哈爾濱 150036)
腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要病理機制,腦血流中斷和再灌注使腦細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應,病理級聯(lián)反應的惡性循環(huán)導致機體處于持續(xù)的惡性應激刺激狀態(tài),從而引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡功能的紊亂,繼而加重腦缺血再灌注損傷。神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié),其中腦啡肽中 β-EP和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu與腦缺血再灌注損傷密切相關。本實驗采用免疫組織化學技術(shù)檢測下丘腦組織中 β-EP、Glu蛋白表達水平,從神經(jīng)遞質(zhì)角度研究電針經(jīng)穴通過調(diào)控下丘腦中β-EP、Glu蛋白表達水平而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷后腦保護作用的機制。
免疫組化 β-EP、Glu試劑盒,武漢博士德公司;免疫組化二抗試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)公司;研究用生物顯微鏡,日本 OLYMPUS BX60;輪轉(zhuǎn)式組織切片機,德國Leica 2135型;生物組織包埋機,天津愛華BMJ-1型;Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng),廈門麥克奧迪;KWD-808Ⅱ型電針儀,常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司。
健康Wistar雄性大鼠,體重 250g~300g,由長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心提供,動物許可證號SCKY-(吉)2003-0004。大鼠按體重隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、電針非經(jīng)穴組(模型 +電針非經(jīng)穴)和電針經(jīng)穴組(模型+電針經(jīng)穴)5組,每組均分為1d、3d、7d 3個時間點,每時間點6只動物。模型判斷標準按照 Zea-Longa[1]報道的4分制進行,評分在1~3分的大鼠認為模型制作成功,排除實驗中死亡者與造模后不符合模型判斷標準者。
采用改良線栓法[1]制備大鼠 MCAO再灌注模型。大鼠稱重,按300mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉。仰臥位固定于手術(shù)臺上,備皮消毒后沿頸部正中切開皮膚,沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜,分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA),結(jié)扎 CCA下端,同時結(jié)扎右側(cè)ECA,然后用動脈夾夾住 ICA遠端以暫時止血,在CCA近頸內(nèi)、頸外動脈分叉處剪一小口,將尼龍線插入ICA,稍稍結(jié)扎CCA分叉插線處,然后撤掉ICA遠端動脈夾,將尼龍線順勢緩緩送入,越過翼腭動脈直至顱內(nèi)大腦前動脈近端,深度為18mm~20mm,以阻斷該側(cè)大腦中動脈血流導致腦缺血。2 h后輕輕提拉所留線頭實現(xiàn)大腦中動脈再灌注則造模完成。假手術(shù)組除不插入線栓外,其余同模型組。
1.4.1 選穴 大鼠針灸穴位定位參考《實驗針灸學》[2]附錄中常用實驗動物的針灸穴位。曲池穴位于橈骨近端關節(jié)外側(cè)前方凹陷中;足三里穴位于膝關節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5mm;非曲池穴位于平行曲池外側(cè)旁開5mm;非足三里穴位于平行足三里外側(cè)旁開5mm。
1.4.2 操作方法 電針經(jīng)穴組:大鼠取俯臥位固定,注意固定鼠尾。定穴消毒后,針刺雙側(cè)曲池、足三里穴,調(diào)整好刺激參數(shù),連接刺激電極,針柄接電針治療儀,一極接曲池穴,另一極接同側(cè)足三里穴,疏密波,頻率2/30Hz,電流強度1mA,大鼠以觸須、耳朵微動為度。于再灌注6h后開始針刺,每天針刺1次,連續(xù)針刺,每次30min,取材前2h再針刺1次。
電針非經(jīng)穴組:針刺雙側(cè)非曲池、非足三里穴,其他治療同電針經(jīng)穴組。正常組、假手術(shù)組和模型組動物只捆綁固定,不針刺。
1.5.1 標本采集與處理 實驗結(jié)束后,按300mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉,從心尖部沿左心室插入灌注管至升主動脈入口,剪開右心耳,先用0.9%生理鹽水150ml快速灌注,再用預冷的4%多聚甲醛(0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制)200ml~300ml灌注,先快后慢,直至鼠尾翹起,身體逐漸僵硬,顏色變白為止。迅速斷頭取腦,取下丘腦放入4%多聚甲醛固定液中固定過夜,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、石蠟切片,待測。
1.5.2 指標檢測方法 采用免疫組織化學法檢測下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平,步驟如下:(1)組織切片脫蠟至水;(2)EDTA微波修復抗原;(3)3%H2O2去離子水孵育10min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗 2min×3次;(4)滴加一抗(1∶50),4℃過夜,PBS沖洗2min×3次;(5)生物素化兔抗 IgG,37℃孵育30min,PBS沖洗 2min×3次;(6)DAB顯色,顯微鏡下控制顯色程度;(7)蒸餾水充分沖洗;(8)蘇木素復染、脫水、透明;(9)中性樹脂封片。
1.5.3 結(jié)果判定與分析方法 陽性表達細胞胞漿呈棕黃色,陰性細胞核呈藍色。采用 Motic Med6.0圖像分析系統(tǒng),每組每時間點各選6張切片,每張切片在400倍下隨機選取6個非重疊視野,按照512×512像素分布攝入圖像并保存病理圖像分析系統(tǒng)內(nèi),選擇免疫組化分析模塊,通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)分視野內(nèi)陽性信號面積,計算陽性目標總面積與統(tǒng)計場總面積比值,取陽性目標面密度平均值進行統(tǒng)計學分析。
表1、圖1~圖13顯示,正常組與假手術(shù)組各時間點β-EP蛋白表達均無顯著性差異(P>0.05);模型組缺血再灌注ld,β-EP蛋白表達明顯升高,持續(xù)7d仍維持較高水平,與同時間點正常組、假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01);電針經(jīng)穴組與同時間點模型組、電針非經(jīng)穴組比較,β-EP蛋白表達明顯增高(P<0.01,P<0.05)。
表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠β-EP蛋白表達的比較±s)
表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠β-EP蛋白表達的比較±s)
注:與同時間點正常組比較:**P<0.01;與同時間點假手術(shù)組比較:△△P<0.01;與同時間點電針經(jīng)穴組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01
組β-EP 1d 3d 7d正 常 組 6 0.0246±0.0043 0.0253±0.0041 0.0245±0.0055別n蛋白陽性目標面密度假 手 術(shù) 組 6 0.0266±0.0059 0.0295±0.0042 0.0281±0.0047模 型 組 6 0.1088 ±0.0070**△△▲▲ 0.1068 ±0.0155**△△▲▲ 0.0909 ±0.0123**△△▲▲電針非經(jīng)穴組 6 0.0841±0.0101▲▲ 0.0814±0.0129▲ 0.0716±0.0071▲電針經(jīng)穴組 6 0.0552±0.0058 0.0573±0.0063 0.0569±0.0073
圖1 正常組(×400)
圖2 假手術(shù)組1d(×400)
圖3 假手術(shù)組3d(×400)
圖4 假手術(shù)組7d(×400)
圖5 模型組1d(×400)
圖6 模型組3d(×400)
圖7 模型組7d(×400)
圖8 電針非經(jīng)穴組 1d(×400)
圖9 電針非經(jīng)穴組 3d(×400)
圖10 電針非經(jīng)穴組 7d(×400)
圖11 電針經(jīng)穴組1d(×400)
圖12 電針經(jīng)穴組3d(×400)
圖13 電針經(jīng)穴組7d(×400)
表2、圖14~26顯示,正常組與假手術(shù)組各時間點Glu蛋白表達均無顯著性差異(P>0.05);模型組缺血再灌注ld,Glu蛋白表達明顯升高,持續(xù)7d仍維持較高水平,與同時間點正常組、假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P<0.01);電針經(jīng)穴組與同時間點模型組、電針非經(jīng)穴組比較均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。
表2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠Glu蛋白表達的比較±s)
表2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠Glu蛋白表達的比較±s)
注:與同時間點正常組比較:**P<0.01;與同時間點假手術(shù)組比較:△△P<0.01;與同時間點電針經(jīng)穴組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01
組Glu 蛋白陽性目標面密度1d 3d 7d正 常 組 6 0.0378±0.0047 0.0371±0.0021 0.0410±0.0071別n假 手 術(shù) 組 6 0.0409±0.0110 0.0392±0.0036 0.0383±0.0047模 型 組 6 0.1248 ±0.0171**△△▲▲ 0.1176 ±0.0169**△△▲▲ 0.1030 ±0.0255**△△▲▲電針非經(jīng)穴組 6 0.1105±0.0181▲▲ 0.1044±0.0270▲▲ 0.0974±0.0307▲電針經(jīng)穴組 6 0.0610±0.0093 0.0515±0.0021 0.0518±0.0046
圖14 正常組(×400)
圖15 假手術(shù)組1d(×400)
圖16 假手術(shù)組3d(×400)
圖17 假手術(shù)組7d(×400)
圖18 模型組1d(×400)
圖19 模型組3d(×400)
圖20 模型組7d(×400)
圖21 電針非經(jīng)穴組 1d(×400)
圖22 電針非經(jīng)穴組3d(×400)
圖23 電針非經(jīng)穴組7d(×400)
圖24 電針經(jīng)穴組1d(×400)
圖26 電針經(jīng)穴組7d(×400)
腦缺血再灌注損傷是指腦缺血一定時間恢復血液灌注后,腦組織細胞損傷反而進行性加重的病理現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷病理級聯(lián)反應的惡性循環(huán)導致機體處于持續(xù)的惡性應激刺激狀態(tài),從而引起NEI網(wǎng)絡功能的紊亂,進一步加重腦缺血再灌注損傷[3]。神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同組成一個網(wǎng)絡狀的結(jié)構(gòu)和功能體系,三大系統(tǒng)具有共同的生化基礎,三者各具特點又密切相關,共同調(diào)控和整合機體內(nèi)、外環(huán)境的平衡。下丘腦是NEI網(wǎng)絡的高級整合中樞,為探討腦缺血再灌注損傷后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化,本實驗將下丘腦作為實驗觀測的主要部位,以期揭示腦缺血再灌注損傷后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì) β-EP、Glu蛋白表達的變化規(guī)律。
β-EP是神經(jīng)細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學活性的內(nèi)源性阿片肽,廣泛存在于垂體、下丘腦、大腦皮層、海馬回、腦干、血漿和腦脊液中,其中以下丘腦和垂體含量最高??赏ㄟ^神經(jīng)分泌、旁分泌和內(nèi)分泌三種途徑分別起到神經(jīng)激素、神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)變物的作用,參與多種生理功能的調(diào)節(jié),同時也參與許多疾病和應激的病理過程。近年研究表明:腦缺血時 β-EP釋放是造成卒中病理損害的重要環(huán)節(jié)[4],使用阿片受體拮抗劑納絡酮治療腦卒中有效以來[5、6],證明內(nèi)啡肽拮抗劑可減輕、阻止甚至逆轉(zhuǎn)由內(nèi)啡肽所造成腦缺血再灌注損傷,拮抗 β-EP活性,減少內(nèi)源性 β-EP的釋放,降低腦組織總鈣和氧自由基水平,減少梗死體積,防止缺血性損害擴展。
Glu是腦組織中含量較高的一種重要氨基酸,同時也是一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)。自1971年 olney首次提出“興奮性毒性”解釋缺血后Glu升高所引發(fā)的病理生理變化后,普遍認為氧和糖供應減少引起的神經(jīng)元死亡,是因于細胞外興奮性氨基酸(EAA)遞質(zhì)劇增的結(jié)果,特別是 Glu。EAA指Glu和天冬氨酸(Asp),腦缺血再灌注時,大量的Glu使神經(jīng)元持續(xù)去極化,增加了神經(jīng)元內(nèi)Glu的大量釋放;又因腦缺血后ATP消耗,依賴能量而重吸收Glu的機制衰竭,影響Glu攝取功能,甚至出現(xiàn)Glu向細胞外液轉(zhuǎn)移,如此惡性循環(huán),突觸間隙持續(xù)高濃度的Glu就引起興奮性神經(jīng)毒性,造成損傷[7]。
本研究結(jié)果顯示,與正常組、假手術(shù)組比較,模型組各時間點 β-EP、Glu蛋白表達均明顯增高,表明下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平與腦缺血再灌注損傷密切相關。電針經(jīng)穴組與同時間點模型組比較,β-EP、Glu蛋白表達明顯降低,表明電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用。電針經(jīng)穴組與同時間點電針非經(jīng)穴組比較,β-EP、Glu蛋白表達明顯降低,表明電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達的調(diào)節(jié)具有相對特異性。
腦缺血再灌注損傷可使下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)功能紊亂,進一步導致NEI網(wǎng)絡功能紊亂而加重腦缺血再灌注損傷,電針經(jīng)穴具有調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達的作用,從而進一步調(diào)控NEI網(wǎng)絡功能紊亂而發(fā)揮腦缺血再灌注損傷腦保護作用??傊?,電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制可能與電針經(jīng)穴調(diào)節(jié)下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平有關。
[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.
[2]李忠仁.實驗針灸學.中國中醫(yī)藥出版社[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003.327-329.
[3]蔡玉穎,劉志順,王順,等.電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠 HPA軸相關激素的影響[J].針刺研究,2009,34(5):297-303.
[4]付慧芳,陳瑞,于培蘭,等.高壓氧對大鼠短暫腦缺血降鈣素基因相關肽和 β-內(nèi)啡肽的影響[J].首都醫(yī)科大學學報,2005,26(4):435-437.
[5]王濤,陳莉,文亮.納洛酮對減輕全腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷作用的實驗研究[J].中國急救醫(yī)學,2001,2(4):196-198.
[6]趙麗哪,呂佳宏.納洛酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織梗塞體積的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2006,29(3):73.
[7]吳喆,趙宇陽,康秋君,等.谷氨酸代謝變化與腦缺血損傷[J].中國實用醫(yī)藥,2008,3(2):101-103.