冀華,潘登奎

(山西農業(yè)大學文理學院,山西太谷,030801)

電泳法是本科生生物化學實驗中一門重要技術,我國現(xiàn)常用的方法是醋酸纖維薄膜電泳[1,2]。醋酸纖維薄膜電泳分離及分析人血清蛋白作為一項基本方法,從20世紀70年代末到今天,依然是本科生生物化學實驗教學中重要的教學內容之一[3,4]。該法操作簡便,效果直觀,本應通過人血清蛋白電泳圖譜分析讓學生盡快掌握蛋白質電泳分離技術基本原理。然而,受傳統(tǒng)點樣器點樣量可控性差及點樣位置等因素影響,使得易變因素較多,學生操作不易,尤其缺乏重復性[5]。因此,本科生一般在3個學時的實驗時間內,在一張膜上、一次點樣操作下,很難取得理想的電泳效果。這樣不僅大大影響了實驗教學技能訓練效果,影響學生對技術方法的可信度,而且會影響學生對電泳實驗技術原理的深刻理解。隨著教育質量工程建設工作的不斷深入,實驗教學改革愈來愈受到國際國內高校的重視[6]。因此根據多年來的實驗管理和實驗教學工作經驗,本實驗室就醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白技術中存在主要的問題,對點樣器進行了改進性研究,結合GIS-2009成像分析儀分析技術,取得了一定的綜合性教學效果,希望能得到國內同行的認可和采納。

1 材料與方法

1.1 材料

人血清(太谷縣人民醫(yī)院檢驗科提供);醋酸纖維薄膜(型號:2 cm×8 cm,浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠提供)。

1.2 實驗試劑

染色液[0.5%的甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水(去離子水)=50∶10∶40(V/V)為溶劑配置0.5%的氨基黑],脫色液[甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水(去離子水)=45∶5∶50(V/V)],巴比妥鈉電極緩沖液(pH 8.6)。

1.3 實驗儀器

電泳儀[DYY-III-8B型,由北京六一儀器廠提供],水平電泳槽[DYCZ-28A型,北京六一儀器廠提供],凝膠圖像處理系統(tǒng) 2009[GIS-2009,為上海天能科技有限公司提供],毛細管[內徑0.5 mm,長5 cm],毛細管尖端酒精噴燈加熱后用尖嘴鉗輕輕加壓,使圓形出口變?yōu)闄E圓形即可(詳見示意圖1a);自制點樣器為浙江武義文教針廠產的120型訂書針改制,該訂書針原端面原寬度為1.3 cm寬,用尖嘴鉗將端面折成4 mm,并適當拋光,作為人血清點樣端面(見示意圖1b)。再將其尾部加熱后直接插入到事先準備好的20 mm×10 mm×1 mm有機玻璃片合適位置,作為手持把柄以便于操作。點樣端用尖嘴鉗折成0.5 cm寬,并適當打磨拋光作為人血清點樣品端面。

圖1 改制點樣器示意圖Fig.1 Diagram of improved sample appliance

1.4 試驗方法

點樣量的控制方法:事先用10μL微量注射器,分別取人血清5μL三次,注射到稱量紙上,在萬分之一分析天平上稱量重量之后求得其比重。然后用自制點樣器取樣后于天平上稱重,可求得相應點樣量的體積。

電泳電壓為95 V,電泳時間40 min。

2 試驗結果

2.1 點樣器對人血清蛋白質分離效果的影響

用直徑0.5 mm毛細管、120型訂書針端面和傳統(tǒng)的載玻片端面進行點樣,醋酸纖維薄膜電泳結果見圖2,圖3和圖4。

圖2 毛細管點樣電泳結果Fig.2 Result of capillary electrophoresis

圖3 同一張膜上毛細管改性點樣器點樣結果Fig.3 Result of improved capillary sample appliance in the same membrane

圖4 載薄片與改制點樣器點樣電泳結果Table 4 Result of slides and improved capillary sample appliance

其中圖2為在同一張醋酸纖維薄膜上不同點樣量電泳結果,圖3為同一張醋酸纖維薄膜上點樣3μL樣的重復。從圖2,圖3和圖4電泳分帶清晰度看,圖4泳道3蛋白質條帶清晰度和分離效果最佳,圖2泳道3以及圖3的泳道1和2效果次之,圖4的泳道1、2較差。即因點樣器引起的電泳效果優(yōu)劣順序為:改制的訂書針端面→毛細管點樣→載玻片端面。采用毛細管點樣時,就點樣量多少對電泳結果的影響角度來看,點樣1μL時α1-球蛋白顯得相當微弱(圖 2泳道1),而 3μL最優(yōu)(圖2泳道3),點樣2μL次之(圖2泳道2)。從圖 3結果看,改性的毛細管在同一張醋酸纖維薄膜上,經細心點樣后,重復性比較理想。而且除了明顯可以看到醋酸纖維薄膜電泳應該看到的血清清蛋白、α1-球蛋白 、α2-球蛋白、β-球蛋白和 γ-球蛋白五條帶之外,在β-球蛋白和γ-球蛋白帶之間還能看到一條γ-球蛋白條帶。

用傳統(tǒng)的載玻片端面點樣(圖4泳道1,泳道2)和采用改制的訂書針端面點樣電泳結果(圖4泳道3,泳道4)對比分析,就分帶效果來看,采用改制的訂書針端面點樣效果明顯優(yōu)于載玻片端面點樣效果。其一,改制訂書針端面點樣電泳結果中,各種蛋白質條帶無明顯拖尾和擴散現(xiàn)象;其二,條帶比較均勻整齊,并且無明顯的邊緣效應。從點樣量對電泳結果的影響角度來看,采用改制的訂書針端面點樣,改制的訂書針端面點樣量控制在3μL時,效果比5μL較好,但總體效果都優(yōu)于載玻片端面點樣的電泳效果(圖4)。

2.2 圖像分析儀對人血清蛋白質分離效果的分析對比

用GIS-2009(凝膠圖像處理系統(tǒng))對圖2和圖4進行分析,可進一步看出不同點樣器點樣電泳結果優(yōu)劣差異。當泳道寬度設置為10,條帶閾值為5,背景類型為“白”,谷峰連結為 30,扣除基線情況下,其圖2的掃描結果見圖5。

圖 5 電泳圖2的GIS掃描曲線Fig.5 GISscan curve of Fig.2

當泳道寬度設置為20,條帶閾值設置為5,背景類型為“白”,谷峰連結為30,扣除基線情況下,其圖4掃描結果見圖6。

圖5和圖6中的縱坐標為相應泳道蛋白質條帶的相對強度,它與蛋白質條帶的顏色深淺、寬窄有關。即條帶越窄、顏色越深,峰頂(Int)越高,曲線下同樣面積情況下峰就越銳。當相鄰峰之間的谷越靠近橫坐標,表明蛋白質的等電點和分子量相近的蛋白質分離的效果越好。

從圖6可以明顯看出,其中掃描曲線(c)圖中,峰 1、峰 2、峰 3、峰 4 和峰 5,不僅峰高 、且銳 ,同時峰與峰之間分隔明顯,而且峰、谷較深。說明采用毛細管點樣3μL人血清于醋酸纖維薄膜上,95V電壓40 min電泳分帶較好。

從圖4的泳道2和泳道3蛋白條帶的整體效果來看,泳道3,即采用改制的訂書針端面點樣效果要優(yōu)于載玻片端面的點樣點用效果。但由于采用GIS-2009(凝膠圖像處理系統(tǒng))分析過程中,限制了條帶的橫向寬度為 20(即總條帶寬度的20%),同時通過泳道移動功能將分析渠道調節(jié)在最佳范圍之內。因此,從圖6的(a)、(b)、(c)和(d)比較可以看出,曲線(c)較曲線(b)峰、谷分隔更明顯可辨,間隔距離以及峰、谷深度較為明顯。

3 討論

生物化學實驗教學的目的與其他課程一樣,主要是用來提高學生的動手能力、培養(yǎng)學生觀察分析問題和解決問題的能力。此外,通過實驗教學過程幫助學生了解相關儀器及操作技能、技術和實驗基本原理,進而為培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力提供基礎[7,8]。因此,醋酸纖維薄膜為載體分離人血清蛋白的電泳實驗,作為現(xiàn)代生物科學及生物化學十大技術之一的入門課程就顯得十分重要[9,10]。醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白質的實驗教學內容,融技術性、重復性、對比性和最終的實驗結果可視性為一體,對于本科生能力的培養(yǎng)不失為很好的教學內容之一。

然而,由于采用傳統(tǒng)的載玻片(2.5 cm×5 cm)端面在醋酸纖維薄膜(2 cm×8 cm)上點樣,主要缺點有兩方面,其一,假如第一次點樣操作有誤,很難在同一張膜上重復,即使要求學生在薄膜的另一端可再次點樣,明顯會影響電泳結果;其二,載玻片端面的寬度超過醋酸纖維薄膜的寬度,血清樣品會橫跨薄膜,蛋白質條帶的邊緣效應十分明顯(如圖4泳道1和2);其三,學生很難一次點樣操作達到理想的控制用量,直接影響蛋白質分離效果。

采用改制的毛細管和改制的訂書針端面點樣,優(yōu)點有三。其一,無論采用改制的毛細管或改制的訂書針端面在同一張醋酸纖維薄膜(2 cm×8 cm)上進行點樣,至少可以重復3次(見圖2和圖3),增加學生的試驗訓練次數。其二,點樣量的可控性遠比載玻片端面容易得多。因此,其三,電泳后得分帶效果比載玻片端面點樣(圖4泳道1和泳道2)后的血清中的清蛋白 、α1-球蛋白 、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白條帶更清晰,且各條帶拖尾現(xiàn)象降低,分離效果更好。

讓學生采用GIS-2009對人血清蛋白質電泳結果采集后,在一定技術標準要求下,如泳道寬度設置為10,條帶閾值為5,背景類型為“白”,谷峰連結為30,扣除基線的情況下進行簡單分析,會很快得出如圖5和圖6的分析結果。設計這樣的一步操作,對學生來說,既增加了一種操作技能訓練,也會增加學生對現(xiàn)代技術手段的感性認識。

圖 6 電泳圖3的GIS掃描曲線Fig.6 GIS scan curve of Fig 3.

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