楊世明 王 穎陳莉莉

(華中科技大學同濟醫(yī)學院解剖學系組織胚胎學教研室;1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院消化內科;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院綜合內科;湖北武漢,430030)

OxLDL誘導人血管內皮細胞及平滑肌細胞DNA加合物生成

楊世明 王 穎1＊陳莉莉2

(華中科技大學同濟醫(yī)學院解剖學系組織胚胎學教研室;1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院消化內科;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院綜合內科;湖北武漢,430030)

目的 探討oxLDL參與動脈粥樣硬化發(fā)生的可能機制。方法 培養(yǎng)人血管內皮細胞及平滑肌細胞,以50μg/LoxLDL刺激24、48h后,收獲細胞用于后續(xù)實驗:①免疫組化染色檢測DNA加合物εdA水平;②免疫組化方法檢測細胞內4-HNE修飾蛋白;③western blot法檢測細胞內4-HNE修飾蛋白水平。結果 oxLDL刺激 EC及SMC中DNA加合物εdA水平及4-HNE修飾蛋白水平均較未刺激細胞組明顯升高。結論 oxLDL誘導的氧化應激、脂質過氧化反應及其繼發(fā)的DNA損傷可能為oxLDL參與動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制。

動脈粥樣硬化;氧化低密度脂蛋白;脂質過氧化作用;亞乙烯基-DNA加合物;人內皮細胞和平滑肌細胞

動脈粥樣硬化是世界范圍內嚴重威脅人類健康的疾病。許多動脈粥樣硬化相關的危險因素已為人們逐漸識別,但其確切發(fā)病機制仍遠遠未被闡明。目前認為參與其發(fā)病的細胞類型主要包括有內皮細胞(endothelialcells,EC) 和 平 滑 肌 細 胞(smooth muscle cells,SMC)[1-3]。

脂質代謝的異常,特別是氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)誘導 EC功能紊亂和SMC細胞增生[4],被認為是參與動脈粥樣硬化發(fā)生的重要危險因素[5],然而其機制尚不明了。近年來研究表明, oxLDL可導致細胞氧化應激,引起活性氧分子(ROS)過度生成,繼而誘發(fā)脂質過氧化反應(LPO),而后者被認為是參與動脈粥樣硬化病變的關鍵機制[6-7]。我們以往的研究曾證實,動脈粥樣硬化患者的主動脈內皮細胞內存在LPO相關的DNA損傷[8]。LPO反應產物—反應性醛類化合物4-hydroxy-2-nonenal(4-HNE),不僅能修飾胞漿蛋白形成各分子量的4-HNE蛋白加合物,而且能進入細胞核與DNA堿基作用形成氧化性DNA加合物—1,N6-ethenodeoxyadenosine(εdA),εdA可誘導細胞基因的異常改變,從而引起細胞的異常增生和功能紊亂[9]。

那么oxLDL是否通過誘導EC和SMC的氧化應激及脂質過氧化反應,引起氧化性DNA損傷, DNA加合物εdA生成,從而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生?目前還未見有研究報道。因此,通過εdA半定量檢測方法[10],在細胞水平以oxLDL刺激人EC和SMC細胞,并檢測細胞內4-HNE蛋白加合物及εdA水平,以初步探討oxLDL參與動脈粥樣硬化發(fā)生的機制。

材料和方法

1 材料

胎牛血清(FBS),胰蛋白酶/EDTA,培養(yǎng)基DMEM以及青/鏈霉素購自Biochrom A G公司(Germany)。蛋白酶K及RNA酶購自Roche公司(Germany)。Tween 20、Triton X-100、小牛血清白蛋白(BSA)等購自 Sigma公司。4-HNE抗體購自 ALEXIS Biochemicals(AXXORA,Germany)。生物素化馬抗鼠及羊抗兔IgG,ABC試劑盒(VECTASTAIN Elite ABC kit),和DAB顯色試劑盒購 自Merck(Darmstadt,Germany)。εdA特異性抗體EM-A-1由Drs.M.Rajewsky和P.LorenzN(University of Essen,Essen,Germany)惠贈[11]。

2 細胞培養(yǎng)及oxLDL處理

采用臍靜脈分離人血管內皮細胞(HUVEC), 50ml PBS沖洗臍靜脈后,0.25mg/ml膠原酶B灌注,于37°C孵育20min后,PBS洗,離心10min。沉淀重懸至5ml內皮細胞生長培養(yǎng)基中,接種于25cm2培養(yǎng)皿,常規(guī)條件下培養(yǎng)。當細胞生長融合后,以冷PBS洗,胰蛋白酶/EDTA消化。再次離心后,細胞重懸于內皮細胞生長培養(yǎng)基中,接種于75cm2培養(yǎng)皿,傳代3-5次后,用于后續(xù)實驗。

人平滑肌細胞由Dr.Xiaobo Chen(Heidelberg University,Germany)惠贈,常規(guī)條件下培養(yǎng),傳代6-8次后用于后續(xù)實驗。

HUVEC和HVSMC分別以2×104/每孔密度接種于0.2%gelatin包被的玻片,細胞融合后以50μg/mLoxLDL分別刺激24、48h。對照組 HUVEC和 HVSMC細胞以正常血清代替oxLDL。 oxLDL刺激結束后,PBS洗滌,細胞爬片以冷丙酮固定后,供免疫組化染色用。

3 εdA加合物免疫組化染色檢測

用免疫組化方法檢測HUVEC和HVSMC細胞εdA水平。細胞爬片 PBS洗滌后,0.3% H2O2/甲醇溶液處理10min,以消除內源性過氧化物酶活性,經 ProteinaseK(10μg/ml)室溫10min,100μg/ml RNase,37°C孵育 1h,1.5N HCl溶液室溫5min后;雙蒸水洗,滴加8%BSA +2%馬血清+0.05%Tween20+0.05%Triton X-100溶液,室溫20min,以封閉非特異性結合位點。鼠抗人εdA抗體EM-A-1(1∶20),4°C過夜。PBS洗后,滴加生物素化馬抗鼠 IgG(1∶500),室溫孵育1h,ABC作用30min,DAB顯色。以正常血清代替一抗作陰性對照。

4 εdA加合物免疫組化染色半定量分析

顯微鏡下觀察結果并獲取圖像(Leica IM50),以相應圖像軟件(Image J,Toronto Western Research Institute,U K)計數陽性染色核,εdA表達率用以下公式計算:陽性染色細胞數/總細胞數× 100%。

5 免疫組化染色檢測4-HNE蛋白加合物

細胞爬片以 0.3% H2O2/甲醇溶液處理10min,以消除內源性過氧化物酶活性,PBS洗后,加3%正常羊血清,室溫20min,以封閉非特異性結合位點。兔抗人4-HNE抗體(1∶500)室溫孵育2h,PBS洗后,滴加生物素化羊抗兔IgG(1∶1000),室溫孵育 30min,ABC作用 30min后, DAB顯色。以正常血清代替一抗作陰性對照。

6 Western blot檢測4-HNE修飾蛋白

采用western blot方法檢測各組 EC及 SMC細胞4-HNE修飾蛋白以反應細胞4-HNE水平,上述oxLDL刺激組及對照HUVEC和HVSMC細胞分別提取蛋白質后,以50μg/每孔上樣,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉至硝酸纖維素膜,以脫脂奶粉封閉1h,加兔抗人 HNE多克隆抗體(1∶1000),40C過夜,含 0.2%TweenPBS溶液(PBST)清洗3次,HRP標記羊抗兔 IgG(1∶2000)室溫孵育1h,PBST洗后,ECL顯色。根據Marker確定不同分子量4-HNE修飾蛋白,以β-action作為內參照。

7 統計學分析

所有數據以平均值±SD表示,采用t檢驗,P值小于0.05具有統計學意義。

圖1 A-H免疫組化顯示EC(A-D)和SMC(E-H)中εdA陽性染色×400。未刺激細胞中未見有εdA陽性染色,ox-LDL(50μg/mL)刺激可誘導EC和SMC細胞中εdA生成明顯增加。A:對照組EC(24h);B:oxLDL刺激EC(24h),C:對照組EC(48h);D:oxLDL刺激 EC(48h);E:對照組SMC(24h);F:oxLDL刺激SMC(24h);G:對照組SMC(48h);H:oxLDL刺激SMC(48h)。Fig1.A-H micrographs(40×)of immunohistochemically stained sections of EC(A-D)and SMC(E-H) ×400.Untreated control cells lack staining forεdA,while oxLDL(50μg/mL)stimulation after 24h and 48h lead to increased staining for DNA adducts in nuclei of EC and SMC.A:Control EC(24h);B:oxLDLstimulated EC(24h),C:Control EC(48h);D:oxLDLstimulated EC(48h);E:Control SMC(24h);F:oxLDLstimulated EC(48h);G:Control SMC(48h);H:oxLDLstimulated SMC(48h).

結 果

1 oxLDL可誘導EC和SMC細胞中εdA形成

與未刺激EC細胞相比,oxLDL刺激后EC細胞組εdA水平顯著上升(圖1 A-D),刺激24h后εdA水平可達10.29±1.61 Units(P=0.008), 48hεdA水平可達25.71±1.47 Units(P=0.001)。

oxLDL刺激組SMC細胞εdA水平亦明顯高于未刺激SMC細胞(圖1 E-H),刺激24h后εdA水平達25.36±3.29 Units(P=0.006),48h后εdA水平可達44.08±4.10 Units(P=0.003)。

2 oxLDL刺激EC和SMC細胞中4-HNE蛋白加合物形成

4-HNE可修飾蛋白質形成4-HNE蛋白加合物,我們采用免疫組化染色和western blot方法檢測oxLDL刺激后 EC(圖2 A,B)和SMC細胞(圖2 C,D)中4-HNE蛋白加合物形成,以反映細胞脂質過氧化狀態(tài)及4-HNE水平。

圖2 A-D免疫組化染色顯示EC(A,B)和SMC(C,D)內4-HNE蛋白加合物形成 ×400。未刺激細胞胞漿內未見4-HNE蛋白加合物陽性染色,而oxLDL刺激24h的EC及SMC細胞胞漿內可見有明顯的4-HNE蛋白加合物形成。A:對照組EC;B:oxLDL刺激EC;C:對照組SMC;D:oxLDL刺激SMC。Fig.2 A-D Immunohistochemical detection of 4-HNE modified proteins in EC(A,B)and in SMC(C,D)in the cytoplasm,×400.Untreated control cells show no brown staining while oxLDL-stimulation for 24h lead to positive staining for 4-HNE adducted proteins in the cytoplasm.A:Control EC(24h),B:oxLDLstimulated EC(24h), C:Control SMC(24h);D:oxLDLstimulated SMC(24h).

Western blot檢測亦發(fā)現在oxLDL刺激的EC細胞內可有多個4-HNE蛋白加合物陽性條帶形成(圖3A),以37.4 KDa和63.8KDa處4-HNE蛋白加合物的水平作相對定量分析(目的蛋白光密度/內參照β-action光密度),其較未處理細胞組升高5倍(圖4A)。

圖3 A,B Western blot顯示oxLDL刺激 EC(A)、SMC(B)細胞內4-HNE蛋白加合物的陽性條帶。Fig.3 A,B Western blot of 4-HNE-adducted proteins in EC(A)and SMC(B)after stimulation by oxLDLfor 24 h is performed using an anti-4-HNE primary antibody with a peroxidase conjugated secondary antibody.Bands a detected by chemiluminescence.

圖4 A,B直方圖顯示在37.4和63.8 KD處,oxLDL刺激EC(A)and SMC(B)細胞4-HNE蛋白加合物水平較未處理細胞明顯升高。Fig.4 A,B Histograms of individual densitometry results for EC(A)and SMC(B)treated with oxLDLfor 24 h.Densitometry is performed on the 37.4 and 63.8 KD bands and plotted as the ratio of 4-HNE-modified protein/beta-actin bands.The histograms are representative blots from three experiments+/-SD.

在oxLDL刺激的SMC內,也可見到明顯的4-HNE蛋白加合物陽性條帶(圖 3B),以 37.4 KDa和63.8KDa處4-HNE蛋白加合物的水平作相對定量分析(目的蛋白光密度/內參照β-action光密度),較未處理細胞組升高3倍(圖4B)。

討 論

越來越多的證據顯示,氧化應激,ROS的過度形成及繼發(fā)的LPO是引起血管內皮細胞和平滑肌細胞功能紊亂的重要因素,其可能為參與動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵機制之一[12]。

有研究顯示人動脈粥樣硬化斑塊中檢測LPO來源的 DNA加合物εdA和εdC,水平明顯升高[8]。DNA加合物是一類高度致突變物質,可在哺乳動物細胞引起基因的點突變[13],而有研究顯示在動脈粥樣硬化動物模型中,LPO來源的DNA加合物是氧化應激誘導的DNA損傷的標志[14]。這些結果在一定程度上支持動脈粥樣硬化斑塊為單個突變SMC細胞異常增殖形成的“腫瘤性病變”學說[15]。

oxLDL是近年來發(fā)現的致動脈粥樣硬化的重要危險因素,可能參與其發(fā)生的早期事件。以往研究認為oxLDL促炎性反應及細胞毒作用可能是其參與動脈粥樣硬化發(fā)生的主要機制,然而近年來的研究顯示oxLDL亦可誘導EC和SMC細胞氧化應激,ROS過度生成、脂質過氧化反應[6,7,16]。

為了闡明oxLDL參與動脈粥樣硬化發(fā)病的機制,我們利用oxLDL處理EC和SMC細胞,檢測并分析細胞內oxLDL誘導LPO源性DNA加合物(εdA)和蛋白加合物的水平。oxLDL刺激的 EC和SMC細胞內εdA及4-HNE修飾蛋白的水平明顯升高,提示oxLDL通過氧化應激,誘導脂質過氧化反應,導致εdA水平升高可能為其參與動脈粥樣硬化發(fā)生的機制之一。

oxLDL誘導細胞DNA損傷的機制仍有待于進一步闡明,但目前推測ROS,LPO及4-HNE可能為重要因素[17]。據報道,oxLDL可誘導培養(yǎng)內皮細胞4-HNE水平明顯上升[7],另有研究表明,以oxLDL刺激APOE鼠后,可使動脈粥樣硬化斑塊內4-HNE蛋白—PDGF beta含量明顯增加[16]。我們的研究結果顯示,oxLDL可誘導EC及SMC細胞脂質過氧化反應,繼而導致4-HNE修飾蛋白及DNA加合物εdA生成和積聚,若不能及時被機體清除,可進一步誘發(fā)EC及SMC細胞基因突變,引起細胞的異常增殖和功能紊亂,其可能為ox-LDL參與動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制之一。

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OXIDIZED LOWDENSITY LIPOPROTEIN INDUCES THE FORMATION OF DNA ADDUCTS IN HUMAN VASCULAR ENDOTHELIALAND SMOOTH MUSCLE CELLS

Yang Shiming,Wang Ying1＊,Chen Lili2
(Division ofHistology and Embryology,Department of A natomy,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology;1Department of Gastroenterology;2Department of Geriatrics,A f f iliated Tongji Hospital ofTongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China)

Objective To investigate the pathogenesis of oxidized LDL(oxLDL)in the progression of atherosclerosis.Methods To correlate oxLDLand macromolecular damage,we measured levels of LPO-derived miscoding etheno-DNA adducts and LPO-modified proteins in cultured human vascular endothelial and smooth muscle cells after incubation with oxLDLfor up to 48h.A semi-quantative analysis method for 1,N6-etheno-deoxyadenosine(εdA)by immunohistochemistry was applied.Results After oxLDLstimulation,a marked and significant increase ofεdA-stained nuclei was found in both endothelial and smooth muscle cells.Similarly,4-hydroxy-2-nonenal- modified proteins,as analyzed by immunohistochemistry and Western blot,showed a 3-5 fold increase.Conclusion LPO-derived etheno-DNA adducts and LPO-modified proteins are strongly induced by oxLDLin human vascular endothelial and smooth muscle cells.This macromolecular damage may contribute to the dysfunction of arterial endothelium and the onset of atherosclerosis.

Atherosclerosis;Oxidized LDL;Lipid peroxidation;Etheno-DNA adduct;Human endothelial and smooth muscle cells

R329

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.016

2009-09-04

2010-03-02

楊世明,男(1967年),漢族,主管技師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)