謝靈瑤，楊俊卿，黃 硯（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶市 400016）

環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）生成系列前列腺素衍生物（Prostaglandins，PGs）的限速酶，COX可分為結(jié)構(gòu)型COX-1和可誘導(dǎo)型COX-2。越來越多的研究[1，2]證明炎癥因子COX-2在造成腦損傷過程中有著十分重要的位置，且在炎癥或損傷時，COX-2在神經(jīng)元上高表達(dá)。另有研究[3]表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子PGs及COX-2的表達(dá)與神經(jīng)元損傷退變有密切關(guān)系，它們參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。美洛昔康是COX-2選擇性抑制劑。本課題組前期研究[4，5]表明，美洛昔康對鋁負(fù)荷所致急、慢性腦組織損傷具有明顯的改善作用，但由于在體實(shí)驗影響因素較多，為進(jìn)一步證實(shí)美洛昔康對腦損傷的保護(hù)作用，本文采用海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，在細(xì)胞水平觀察美洛昔康對鋁鹽致神經(jīng)元損傷的作用，并且初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

新生24 h內(nèi)SD（Sprague-Dawley）乳鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（渝）2002000。

美洛昔康（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，批號：07050，純度：100.5%）；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：1361834）、B27培養(yǎng)基（批號：1290007）均由美國Gibco公司提供；特級胎牛血清（天津灝洋公司，批號：XA070621HY）；多聚-L-賴氨酸（批號：AR0003）、MTT（批號：SP1090，使用時以磷酸鹽緩沖液（PBS）制備成5 mg·mL－1溶液備用）均由美國Sigma公司提供；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（批號：BA0535）、抗體稀釋液（批號：AR1016）均由武漢博士德生物工程有限公司提供；免疫組化SP（Streptavidin-perosidase）試劑盒（批號：K86922E）、DAB（3，3′-diaminobenzidine）顯色劑（批號：375230AJ）均由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20090226）、超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒（批號：20090318）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20090318）均由南京建成生物工程研究所提供；氯化鈉（NaCl）、六水三氯化鋁（AlCl3·6H2O）均為國產(chǎn)分析純。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

出生24 h內(nèi)的乳鼠，以75%乙醇消毒后分離出海馬，盡量除去血管，以D-Hank’s液洗3次，放入冰袋上裝有D-Hank’s的燒杯中，用眼科剪將組織盡量剪碎。加入5倍組織體積的0.125%胰酶，37℃消化30 min，期間每10 min振搖1次。加入等體積的20%培養(yǎng)液終止消化。200目細(xì)胞篩過濾。取細(xì)胞懸液800 r·min－1離心8 min，除去胰酶。2次離心后，加入一定量的20%培養(yǎng)液分散沉淀，配成細(xì)胞密度為每升1×106個的細(xì)胞懸液，種植于賴氨酸處理過（爬片浸于賴氨酸溶液中2 h，超凈臺內(nèi)風(fēng)干備用）的24孔板或96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h神經(jīng)元貼壁后，換B27無血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d半量換液1次，神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天可以長到較好的狀態(tài)。

1.3 NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

取24孔板中培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元爬片（10 mm×10 mm），PBS洗3次，用95%乙醇固定40 min后，按下列操作順序進(jìn)行：（1）PBS洗3次，每次5 min；（2）3%H2O2去離子水孵育20 min；（3）PBS洗3次，每次5 min；（4）正常山羊血清工作液中孵育1 h；（5）NSE多克隆抗體-抗體稀釋液（1∶75）滴于爬片上細(xì)胞表面，4 ℃放置過夜；（6）PBS洗3次，每次5 min；（7）生物素標(biāo)記羊抗兔IgG中孵育2 h；（8）PBS洗3次，每次5 min；（9）辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液中孵育20 min；（10）PBS洗3次，每次5 min；（11）DAB 顯色，10 min；（12）流水終止染色 10 min；（13）反應(yīng)終止后，加入蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。胞漿內(nèi)成彌漫性棕色，胞核著色藍(lán)色者為神經(jīng)元。

1.4 MTT法測定

96孔板中大鼠神經(jīng)元培養(yǎng)第7天后分成空白對照組、鋁模型組、美洛昔康大、中、小劑量組?？瞻讓φ战M加入200 μmol·L－1的NaCl培養(yǎng)液，鋁模型組加入200 μmol·L－1的AlCl3培養(yǎng)液，美洛昔康小、中、大劑量組分別加入200 μmol·L－1的AlCl3+10－8mol·L－1、10－7mol·L－1、10－6mol·L－1的美洛昔康（均為終濃度）。在藥物作用24 h后，每孔加入5 mg·mL－1的MTT溶液20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，除去上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩以溶解結(jié)晶。于570 nm波長處讀取光密度（OD）值，從OD值判斷神經(jīng)元存活力高低，OD值越高，神經(jīng)元存活力越高。

1.5 LDH活性測定

接種于24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。在加入藥物處理作用24 h后，收集培養(yǎng)液上清0.03 mL（設(shè)為A溶液），用于測定釋放入培養(yǎng)液的LDH總活性。再用胰酶消化各孔細(xì)胞，加入生理鹽水1 mL，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞（冰上進(jìn)行）1 min，低溫離心收集上清液0.03 mL（設(shè)為B溶液），用于測細(xì)胞內(nèi)的LDH總活性。測定方法按照LDH測定試劑盒中操作說明書進(jìn)行。于440 nm波長處檢測OD，計算LDH活性和漏出率：LDH活性（IU·g－1prot）＝（測定管OD值－測定空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值）×2（μmol·mL－1）/蛋白濃度（mg·mL－1）；LDH漏出率＝A溶液LDH活性/（A溶液LDH活性+B溶液LDH活性）×100%。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。通過計算LDH漏出率判斷神經(jīng)元損傷情況，LDH漏出率越高，說明神經(jīng)元損傷越明顯。

1.6 SOD活性和MDA含量測定

接種于24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。在藥物作用24 h后，加入胰酶消化細(xì)胞，加入生理鹽水220 μL，低溫下超聲波破碎細(xì)胞、收集上清液0.2 mL，分別按SOD、MDA試劑盒中操作說明書進(jìn)行測定，測定波長分別為550、532 nm，SOD活性、MDA含量計算公式如下：SOD活性（IU·mg－1prot）＝（對照管OD值－測定管OD值）/對照管OD/50%×反應(yīng)液總體積/取樣量（mL）/蛋白含量（mg·mL－1）；MDA含量（nmol·mg－1prot）＝（測定管OD值－測定空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值）×10（nmol·mL－1）/蛋白濃度（mg·mL－1）。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.7 神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察

接種于置有載玻片（10×10 mm）的24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。取藥物作用24 h后的神經(jīng)元爬片，PBS洗3次，95%乙醇固定40 min，中性樹脂固定，PBS沖洗3次，HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSE鑒定結(jié)果

倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞胞體飽滿，樹突與軸突明顯，細(xì)胞突起連接成網(wǎng)狀。NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，陽性細(xì)胞胞體及軸突呈棕黃色，蘇木精復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)色。隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞中NSE陽性細(xì)胞數(shù)，陽性百分率超過95%，見圖1。

圖1 原代大鼠海馬NSE免疫鑒定Fig1 Immunocytochemistry staining of NSE in primary cultured hippocampal neurons in rats

2.2 MTT法結(jié)果

各組OD值見表1。

表1 各組OD值比較（±s）Tab 1 Comparison of OD value in each group（±s）

表1 各組OD值比較（±s）Tab 1 Comparison of OD value in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.05，##P＜0.01

OD 0.76±0.05 0.58±0.05＊0.64±0.03#0.67±0.06#0.69±0.06##組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n6 6 6 6 6

由表1可見，與空白對照組比較，鋁模型組OD值明顯降低（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康小劑量組、中劑量組OD值顯著升高（P＜0.05），而大劑量組OD值升高更明顯（P＜0.01），提示美洛昔康各劑量組神經(jīng)元存活力提高。

2.3 LDH活性測定

各組LDH漏出率結(jié)果見表2。

由表2可見，與空白對照組比較，鋁模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康小劑量組LDH漏出率顯著降低（P＜0.05），而中劑量組、大劑量組的顯著性差異更明顯（P＜0.01）。說明美洛昔康各劑量組能減少神經(jīng)元的損傷。

表2 各組LDH漏出率比較（±s）Tab 2 Comparison of LDH leakage in each group（±s）

表2 各組LDH漏出率比較（±s）Tab 2 Comparison of LDH leakage in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n6 6 6 6 6 LDH漏出率/%17.13±5.02 35.70±6.02＊28.00±5.49#23.33±4.02##19.20±4.12##

2.4 SOD活性、MDA含量

各組SOD活性和MDA含量測定結(jié)果見表3。

表3 各組SOD活性及MDA含量比較（±s）Tab 3 The activity of SOD and content of MDA in each group（±s）

表3 各組SOD活性及MDA含量比較（±s）Tab 3 The activity of SOD and content of MDA in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.01

組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n 6 6 6 6 6 SOD/IU·mg－1prot 76.55±5.28 45.58±7.29＊69.55±4.62#70.72±5.08#77.19±3.67#MDA/nmol·mg－1prot 2.11±0.62 4.13±0.61＊2.78±0.63#1.97±0.60#1.49±0.40#

由表3可見，與空白對照組比較，鋁模型組SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康各劑量組SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

2.5 神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)

各組神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)光鏡下觀察結(jié)果見圖2。

由圖2可見，空白對照組的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞數(shù)目多，突起明顯，連接成網(wǎng)。鋁模型組的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，突起萎縮，有部分神經(jīng)元聚集在一起，甚至破裂死亡。美洛昔康各劑量組與鋁模型組比較神經(jīng)元數(shù)目增加，胞體和突起結(jié)構(gòu)明顯改善。

3 討論

隨著全球人口老齡化的趨勢越來越明顯，以阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）等為代表的神經(jīng)元退行性疾病越來越引起人們的廣泛關(guān)注。

鋁元素是目前公認(rèn)導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因素之一，也是引起AD等老年性癡呆的重要誘因。鋁是一種可在大腦內(nèi)誘導(dǎo)生成自由基的神經(jīng)毒性介質(zhì)，而自由基的不斷累積會使細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)變性，神經(jīng)元死亡，從而引起如AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。由于鋁所引起的神經(jīng)生化變化與AD患者的神經(jīng)化學(xué)變化相似，因此實(shí)驗中常采用鋁鹽建立體內(nèi)和體外神經(jīng)元損傷模型。MTT法間接反映的是活細(xì)胞數(shù)量的多少，其活細(xì)胞數(shù)量與檢測出來的OD值呈正比；而LDH的漏出率反映的是細(xì)胞受損的情況，LDH漏出率越大，說明細(xì)胞受損越嚴(yán)重。SOD可以清除機(jī)體內(nèi)自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，因此SOD活性的強(qiáng)弱間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA的含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度，所以MDA含量的高低反映的是細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

圖2 各組神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×200）Fig 2 Pathomorphology of neurons in each group（HE staining，×200）

NSE是位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)的一種可溶性酸性蛋白，是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物之一。原代神經(jīng)元培養(yǎng)7 d時進(jìn)行鑒定，神經(jīng)元純度達(dá)到95%，故可以用于進(jìn)行原代神經(jīng)元的實(shí)驗研究。本課題中，筆者采用鋁鹽（200 μmol·L－1）處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h，以病理形態(tài)學(xué)、MTT、LDH為觀察指標(biāo)，體外模擬鋁鹽致神經(jīng)元損傷模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，模型組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，突起變短，MTT值和SOD活性降低，LDH漏出率和MDA含量明顯升高，提示筆者的模型建立是成功的，可以用于神經(jīng)元損傷的機(jī)制研究以及藥物作用的觀察。

有報道[6，7]COX-2抑制劑Rofecoxib和Celecoxib對興奮毒所致腦損傷、神經(jīng)元退變有明顯保護(hù)作用。同時有研究[8]證明Aβ1-40肽在成神經(jīng)瘤細(xì)胞中的聚集會誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)，且增強(qiáng)COX-2的活性，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步嚴(yán)重，因此COX-2在以AD為代表的神經(jīng)元退變疾病中有著十分密切的關(guān)系。在本體外細(xì)胞實(shí)驗中筆者發(fā)現(xiàn)，美洛昔康能劑量依賴性改善鋁負(fù)荷導(dǎo)致的神經(jīng)元胞體和突起的損傷、增加神經(jīng)元數(shù)目，不同程度地提高M(jìn)TT值，降低LDH漏出率，同時增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性、降低MDA含量。本研究結(jié)果從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)了美洛昔康對于因鋁負(fù)荷導(dǎo)致原代神經(jīng)元的損傷有著明顯的保護(hù)作用。

美洛昔康改善鋁負(fù)荷導(dǎo)致的離體大鼠海馬神經(jīng)元損傷的機(jī)制則可能是由于其抑制了COX-2活性，減少了炎癥性因子前列腺素的合成，降低了炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮對損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本實(shí)驗結(jié)果表明，美洛昔康對于鋁鹽導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。而以美洛昔康為代表的COX-2抑制劑對于一些神經(jīng)元退變疾病如AD等，可能有一定的臨床應(yīng)用前景。

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