張華英，聞 亞，鄭 琴，王以躍，謝等龍

（浙江海正動物保健品有限公司，浙江 杭州 311400）

美洛昔康（Meloxicam）是一種烯醇類非甾體類抗炎藥，作為世界上第一種選擇性抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑，美洛昔康具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用，它也是目前眾多獲批的用于犬臨床的非甾體抗炎藥中的一種，美洛昔康在犬上有多種臨床給藥途徑，目前在歐洲批準(zhǔn)的有美洛昔康片劑和口服混懸液。本文所研究的美洛昔康咀嚼片，具有適口性好、犬用藥順應(yīng)性高等優(yōu)點，可用于緩解犬急性和慢性肌肉骨骼疾病引起的炎癥和疼痛。為了建立美洛昔康咀嚼片中美洛昔康的含量檢測方法，依據(jù)咀嚼片的特性，排除紫外可見分光光度法和電化學(xué)法，最終選擇高效液相色譜法，成功建立了一種高效、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高的美洛昔康含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器），德國塞多利斯電子分析天平（感量0.00001g），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超純水儀（Milli-Q Advantage A10）。

1.2 試驗藥品甲醇（色譜純、TEDIA），異丙醇（色譜純、TEDIA），磷酸氫二銨（分析純、科密歐），美洛昔康對照品（EP、Y0001080），美洛昔康咀嚼片（浙江海正動物保健品有限公司），批號分別為：P1505001A、P1505002A、P1505003A，規(guī)格為每片含美洛昔康1mg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Welch Xtimate C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以磷酸氫二銨溶液-甲醇-異丙醇（64：32：4）混合溶液為流動相；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；檢測波長為254nm。典型色譜圖（見圖1）：

圖1 美洛昔康咀嚼片含量典型色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取美洛昔康對照品12mg，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5mL，置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品20片，稱定總重，用研缽將片研磨成均勻粉末。精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于美洛昔康1.2mg），置25mL量瓶中，加流動相超聲處理15min，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 供試品溶液的測定按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，將對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得美洛昔康的含量。

2.4 線性關(guān)系考察配制約含美洛昔康450 μg/mL的線性儲備溶液，取線性儲備溶液適量，用稀釋劑定容，制成濃度為22.5、33.75、45.0、56.25、67.5μg/mL的美洛昔康線性溶液，每個濃度點重復(fù)進樣2次，按照2.1的色譜條件進行測定。以美洛昔康對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)濃度測得的平均峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程為y=47607x-8.762，相關(guān)系數(shù)為1，y軸截距占100%濃度峰面積的0.41%。說明美洛昔康在22.5～67.5μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。線性結(jié)果（見圖2）：

圖2 美洛昔康線性關(guān)系圖

2.5 準(zhǔn)確度試驗取線性儲備溶液適量，分別加入到空白輔料中，用稀釋劑定容，制成濃度為22.5、45.0、67.5μg/mL的準(zhǔn)確度溶液，每個濃度配制三份平行樣，按照2.1的色譜條件進行測定。結(jié)果（見表1），三個濃度的回收率分別為101.0%、101.5%和100.6%，RSD值分別為0.3%、0.0%和0.4%，美洛昔康回收率良好。

表1 美洛昔康準(zhǔn)確度結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，每個批次樣品配制6份樣品溶液，依次進樣檢測，并記錄峰面積。結(jié)果（見表2），各批次樣品的RSD在0.4%～0.9%，重復(fù)性較好。

表2 美洛昔康重復(fù)性結(jié)果

2.7 中間精密度試驗中間精密度試驗由另外一名實驗員用不同HPLC系統(tǒng)、不同色譜柱在不同日期采用與“重復(fù)性”試驗中相同批號的成品藥來進行檢測。實驗員A，使用Agilent 1260高效液相色譜儀，配Welch Xtimate C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；實驗員B，使用Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters Symmetry C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果（見表3），各批次樣品的RSD在0.3%～1.0%，中間精密度較好。

表3 美洛昔康中間精密度結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性考察按2.2配制對照品溶液和供試品溶液，分別于25℃放置0、1、2、3d，每天用新配制的對照品溶液計算美洛昔康的含量。取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以美洛昔康含量與最初值比較。結(jié)果（見表4），差值在0.17%～0.65%，小于2.0%。因此對照品溶液和供試品溶液在室溫密封條件下，3d內(nèi)穩(wěn)定。

表4 對照品溶液和供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果

2.9 耐用性考察取P1505001A批次樣品，按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，配制2份平行樣進行耐用性試驗，考察流速、柱溫、波長及流動相比例對含量測定的影響。結(jié)果（見表5），各條件下美洛昔康含量與正常條件結(jié)果的差值均小于2.0%，耐用性良好，對含量測定結(jié)果無影響。

表5 美洛昔康耐用性結(jié)果

3 討論與結(jié)果

3.1 檢測波長的確定取美洛昔康對照品溶液、空白輔料溶液和供試品溶液，使用DAD檢測器進行全波長掃描。美洛昔康在254nm和270nm處均有較大吸收。因空白輔料溶液在270nm處有明顯吸收峰，會干擾主成分的分析，同時參考美洛昔康片國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-332-2）-2003含量檢測方法中規(guī)定的波長254nm，故確定254nm為美洛昔康咀嚼片含量測定的波長。

3.2 稀釋劑的確定許多文獻(xiàn)報道二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康對照品。二甲基甲酰胺作為助溶劑，對加快美洛昔康溶解，改善色譜峰型，平穩(wěn)基線有一定作用，但二甲基甲酰胺作為一種特殊的溶劑，會對色譜柱造成損傷，進而降低色譜柱的柱效及理論塔板數(shù)，不利于檢測任務(wù)的長期重復(fù)進行。參考美洛昔康注射液（農(nóng)業(yè)部公告1296號）中采用0.2%磷酸氫二銨溶液600mL和甲醇-異丙醇（65：10）400mL混合溶液為稀釋劑，通過對不同比例稀釋劑的選擇和比對，最終確定采用磷酸氫二銨溶液-甲醇-異丙醇（64：32：4）為稀釋劑，結(jié)果顯示其對美洛昔康溶解性能良好，得到的峰信號強度比以二甲基甲酰胺為溶劑信號強，純度高，色譜峰峰形對稱；對儀器和色譜柱無污染和損壞。最終建立的美洛昔康咀嚼片含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高。