趙元珍，高春芳

腹部受輻射致嚴(yán)重的急性放射性腸炎，在平、戰(zhàn)時(shí)均可發(fā)生，可導(dǎo)致絨毛破壞，黏膜糜爛，影響食物的消化吸收，并可導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位，目前尚無有效的治療方法。本實(shí)驗(yàn)探討谷氨酰胺對(duì)大鼠急性放射性損傷后腸細(xì)菌易位的影響，并探討其作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 正常SD雄性大鼠30只，體重200～250 g。實(shí)驗(yàn)大鼠在照射前禁食12～14 h，用0.5%戊巴比妥鈉（0.8 ml/100 g體重）腹腔麻醉，一次性用60Co放射治療儀給予全腹部照射8 Gy，然后經(jīng)常規(guī)消毒后，行右頸靜脈插管術(shù)，建成急性放射性腸炎全腸外營(yíng)養(yǎng)大鼠模型，進(jìn)行持續(xù)7 d的全腸外營(yíng)養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組：①正常組（n=10）為未經(jīng)腹部照射的正常大鼠，作為正常對(duì)照；②常規(guī)全腸外營(yíng)養(yǎng)組（STD組，n=10）：大鼠輸入不含有谷氨酰胺的靜脈營(yíng)養(yǎng)液；③谷氨酰胺組（GLN組，n=10）：大鼠輸入含3%丙氨酰-谷氨酰胺 （相當(dāng)于2%谷氨酰胺）的靜脈營(yíng)養(yǎng)液。后兩組靜脈營(yíng)養(yǎng)液的含氮量和非蛋白熱卡均相同。

1．2 檢測(cè)指標(biāo) 連續(xù)7 d全腸外營(yíng)養(yǎng)后，在取材前1 h，經(jīng)頸靜脈（正常組大鼠經(jīng)陰莖背靜脈）注入5－溴脫氧尿苷（BrdU；Sigma公司產(chǎn)品），劑量為50 mg/kg體重[1]（BrdU 濃度為 5 mg/ml，雙蒸水配制，置于冰箱內(nèi)備用），1 h后，動(dòng)物麻醉后，取相應(yīng)腸段，測(cè)定空、回腸組織內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA的含量。剖腹取相應(yīng)空腸和回腸，固定于10%的中性甲醛中，固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm。常規(guī)切片HE染色，免疫組織化學(xué)染色采用ABC法，抗－BrdU（美國(guó)Sigma公司）。常規(guī)切片光鏡下觀察腸隱窩細(xì)胞有絲分裂象并計(jì)數(shù)，免疫組化切片光鏡下觀察被BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞，在小腸上皮細(xì)胞中分布的位置，并用文獻(xiàn)[2]的方法，計(jì)數(shù)每個(gè)隱窩內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，以整個(gè)細(xì)胞核染色為陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每組采用4只大鼠，每只動(dòng)物的小腸組織采用3張非連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)取中間部位的8～10個(gè)隱窩，計(jì)數(shù)每個(gè)隱窩內(nèi)細(xì)胞有絲分裂象和免疫組化標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．3 病理學(xué)觀察 取3個(gè)組大鼠回腸取回盲部近端20 cm中部，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察回腸黏膜病理變化，用VIDS半自動(dòng)圖像分析儀（Olivetti，M24 型，英國(guó) AMS 公司生產(chǎn)），隨機(jī)全盲對(duì)每個(gè)標(biāo)本測(cè)量不同部位完整的絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度和腸壁全層厚度。

1.4 電鏡觀察 透射電鏡的標(biāo)本，先切成1 cm3大小的組織塊，固定于2.5%的戊二醛中，用Epon812包埋。透射電鏡下觀察，隨機(jī)和選擇攝片，回腸上皮細(xì)胞的照片，用VIDS半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定回腸上皮細(xì)胞微絨毛的高度，并比較細(xì)胞內(nèi)線粒體的變化。

1.5 腸道內(nèi)細(xì)菌易位的檢測(cè) 在嚴(yán)格無菌的條件下，剖腹取回盲部鏈狀淋巴結(jié)2枚，剪碎后置于葡萄糖蛋白胨試管內(nèi)，37℃條件下培養(yǎng)48 h，接種于普通血平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h行細(xì)菌定性檢查，以檢出大腸桿菌或革蘭陰性桿菌作為陽性結(jié)果。

表 1 3組大鼠空、回腸DNA和蛋白質(zhì)含量（mg/5 cm，±s）

表 1 3組大鼠空、回腸DNA和蛋白質(zhì)含量（mg/5 cm，±s）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與STD組比較，#P<0.05

n 空腸 回腸蛋白質(zhì) DNA 蛋白質(zhì) DNA正常對(duì)照組 6 108.60±23.53 10.13±1.46 104.35±11.87 9.68±1.70 STD 組 6 70.25±16.39* 6.26±1.56* 66.89±13.33* 5.87±1.98*GLN 組 7 93.26±19.67# 8.98±2.79# 91.32±18.77# 8.45±2.13#

表 2 大鼠小腸隱窩細(xì)胞有絲分裂數(shù)（個(gè)/隱窩，±s）

表 2 大鼠小腸隱窩細(xì)胞有絲分裂數(shù)（個(gè)/隱窩，±s）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與STD組比較，#P<0.05

n 空腸 回腸正常對(duì)照組 6 3.16±0.89 2.56±0.38 STD 組 6 3.76±0.87 3.34±0.74 GLN 組 7 6.98±1.07*# 5.55±0.89*#

2 結(jié)果

2.1 空、回腸組織蛋白質(zhì)和DNA含量 正常對(duì)照組空、回腸蛋白質(zhì)和DNA的含量均明顯高于另兩組。谷氨酰胺組（GLN組）組空、回腸蛋白質(zhì)和DNA的含量明顯高于常規(guī)對(duì)照組（STD組），見表1。

2.2 光鏡下觀察 STD組小腸絨毛高度和隱窩深度降低，腸隱窩細(xì)胞有絲分裂象少見，GLN組絨毛高度和隱窩深度較大，隱窩細(xì)胞有絲分裂象多見；3組小腸隱窩細(xì)胞有絲分裂象計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，顯示GLN組細(xì)胞有絲分裂明顯多于其它各組，見表2。

2.3 BrdU標(biāo)記細(xì)胞觀察計(jì)數(shù) 正常對(duì)照組、STD組和GLN組小腸上皮細(xì)胞內(nèi)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞呈棕黃色，底色幾乎呈無色，陽性細(xì)胞很容易辨認(rèn)，陰性對(duì)照片均為陰性。三個(gè)組BrdU陽性細(xì)胞均位于空、回腸黏膜層的腸腺內(nèi)，主要為腸腺基底部的上皮細(xì)胞,胞核呈棕黃色中度陽性反應(yīng)，絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)為陰性，觀察BrdU的陽性細(xì)胞的分布，發(fā)現(xiàn)GLN組的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)多于STD組，統(tǒng)計(jì)分析表明GLN組小腸BrdU陽性細(xì)胞數(shù)多于STD組（P<0.05），而GLN組和正常對(duì)照組兩者無顯著性差異（P>0.05），見表 3。

表3 小腸BrdU陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/隱窩，±s）

表3 小腸BrdU陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/隱窩，±s）

與STD組比較，*P<0.05

n 空腸 回腸正常對(duì)照組 6 11.17±4.56 10.47±3.98 STD 組 6 7.76±2.23 6.53±2.07 GLN 組 7 12.53±3.68* 11.67±3.97*

2.4 回腸的形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察：STD組回腸壁水腫明顯，黏膜出血點(diǎn)多且密集，伴有程度不等的糜爛，而GLN組小腸壁水腫較輕，黏膜出血點(diǎn)少。光鏡下觀察：STD組小腸絨毛局部壞死脫落形成糜爛（8/10例），尤以回腸為甚（9/10例），脫落的上皮細(xì)胞局部形成“偽膜”樣結(jié)構(gòu)，絨毛高度和隱窩深度降低，GLN組絨毛完整（8/10例），絨毛高度和隱窩深度較大。經(jīng)半自動(dòng)圖像分析作定量測(cè)定，GLN組回腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜及全層壁厚度均顯著大于STD組，見表4。

表 4 回腸的形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)量結(jié)果（μm，±s）

表 4 回腸的形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)量結(jié)果（μm，±s）

與STD組比較，#P<0.001

組別 絨毛高度 隱窩深度 黏膜厚度 全層厚度正常組 275.28±12.20 186.30±13.21 465.72±15.35 632.70±17.83 STD 組 258.28±12.69 184.98±13.07 457.96±15.18 604.32±15.39 GLN 組 313.50±11.65#199.74±14.56#519.36±16.89#671.18±17.82#

2.5 小腸電鏡觀察和測(cè)量 透射電鏡下可見GLN組小腸上皮細(xì)胞微絨毛高度為（966.47±82.36）nm，明顯高于STD組的（880.54±176.47）nm。觀察上皮吸收細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的變化，發(fā)現(xiàn)GLN組細(xì)胞內(nèi)線粒體稍有腫脹，但嵴排列整齊，而STD組細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯腫脹，甚至嵴斷裂。

2.6 腸道內(nèi)細(xì)菌易位率 GLN組腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)細(xì)菌易位率為40%（4/10），STD組腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)細(xì)菌移位率為 80%（8/10），GLN組顯著低于STD 組（P<0.05）。

3 討論

腹部受輻射損傷導(dǎo)致急性放射性腸炎，致使絨毛破壞，黏膜糜爛，腸黏膜屏障破壞，影響食物的消化吸收，腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)生易位，而致毒血癥，病死率較高。對(duì)急性放射性腸炎缺乏有效的治療措施，常采用全腸外營(yíng)養(yǎng)（TPN）支持治療，使腸道休息待其自然恢復(fù)，但長(zhǎng)期使用常規(guī)全腸外營(yíng)養(yǎng)后，可導(dǎo)致胃腸道黏膜萎縮，吸收功能受損，腸道內(nèi)細(xì)菌易位增加，血液及組織中GLN含量及小腸對(duì)GLN的攝取下降，從而使放射性腸炎的病死率并沒有得到顯著降低[3]。GLN是小腸黏膜等生長(zhǎng)活躍上皮細(xì)胞合成嘌呤和嘧啶的供氮體，是其生長(zhǎng)、增殖、分化不可缺少的能源物質(zhì)，對(duì)胃腸道黏膜損傷的修復(fù)起重要作用。筆者早先已注意到GLN的利用與急性放射性腸炎腸黏膜損傷的修復(fù)密切相關(guān)[4]。

小腸上皮細(xì)胞是對(duì)放射性損傷敏感性很高、再生能力很強(qiáng)的組織細(xì)胞，受輻射損傷的小腸上皮細(xì)胞常由腸腺上皮的未分化細(xì)胞增生來補(bǔ)充絨毛的上皮細(xì)胞，以逐漸恢復(fù)絨毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性。GLN是胃腸道黏膜細(xì)胞的重要的呼吸能源，是核酸和蛋白質(zhì)合成的供氮體。在應(yīng)激狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞的增殖分化更為活躍，在施行TPN時(shí)，提供外源性GLN對(duì)保證輻射損傷腸上皮細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)更多地合成至關(guān)重要[5]，本文結(jié)果顯示，GLN組小腸的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于STD組。

利用BrdU標(biāo)記S期細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和無放射性等優(yōu)點(diǎn)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組和實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞均位于腸腺上皮細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)檫@些細(xì)胞是絨毛上皮細(xì)胞更新的來源。正常組小腸上皮細(xì)胞BrdU陽性細(xì)胞位于腸腺內(nèi)，說明正常小腸上皮細(xì)胞增殖的活躍性，對(duì)小腸腸腺內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLN組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于STD組，該結(jié)果表明了GLN二肽可促使急性放射性腸炎大鼠損傷小腸上皮細(xì)胞DNA的合成，促使急性放射性腸炎大鼠小腸上皮細(xì)胞的分裂增殖。

筆者還采用了透射電鏡的觀察，結(jié)果顯示，STD組小腸上皮細(xì)胞微絨毛降低和線粒體的結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，而GLN組小腸上皮細(xì)胞微絨毛明顯增高，線粒體破壞較輕，提示GLN可以保護(hù)上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性。此時(shí)微絨毛變化需要線粒體提供的能量，則由GLN提供。而STD組超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可能與射線的損傷所致和常規(guī)TPN不能提供小腸上皮細(xì)胞足夠的能量有關(guān)。

本研究應(yīng)用腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果提示STD組腸細(xì)菌易位率明顯高于GLN組，提示GLN減少腸腸細(xì)菌易位機(jī)制可能與補(bǔ)充外源性GLN，促進(jìn)小腸上皮合成DNA和蛋白質(zhì)，促使受損小腸上皮細(xì)胞的修復(fù)，保持小腸組織結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[4]。小腸壁結(jié)構(gòu)的完整，才能有效地阻止或減少腸道內(nèi)細(xì)菌的移位。同時(shí)也可能與GLN能降低全腸外營(yíng)養(yǎng)所致的腸黏膜通透性增高有關(guān)[5]。

本文結(jié)果表明，附加丙氨酰-谷氨酰胺二肽的TPN具有較強(qiáng)的維護(hù)胃腸道黏膜抗輻射性損傷的作用，能更好地保護(hù)腸屏障功能和防止腸細(xì)菌移位的發(fā)生。

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