謝林利，周 密，陳勇川，熊麗蓉，夏培元（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶市 400038）

黃芩苷、黃芩素抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的研究Δ

謝林利＊，周 密，陳勇川#，熊麗蓉，夏培元（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶市 400038）

目的：研究黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響。方法：選用銅綠假單胞菌X140為研究對象，用32 μg·mL-1的黃芩苷、2 μg·mL-1的黃芩素干預(yù)X140生物膜的培養(yǎng)。以阿奇霉素為對照，采用倍比稀釋法對生物膜內(nèi)活菌菌落計(jì)數(shù)。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同培養(yǎng)條件下生物膜的變化。結(jié)果：32 μg·mL-1的黃芩苷、2 μg·mL-1的黃芩素可以顯著抑制銅綠假單胞菌的黏附性和抑制生物膜的形成（P＜0.01）。結(jié)論：黃芩苷、黃芩素可抑制細(xì)菌生物膜的形成，影響銅綠假單胞菌的黏附性。

生物膜；黃芩苷；黃芩素；銅綠假單胞菌

Δ國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30400598）

＊藥師。研究方向：細(xì)菌耐藥。電話：023-68754404。E-mail：xie.l.l@163.com

#通訊作者：副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥理及臨床藥理學(xué)。電話：023-68765495。 E-mail：zwmcyc@163.com

黃芩的抗菌有效成分為黃酮類化合物，主要包括黃芩苷（Baicalin）、黃芩素（Baicalein）等。筆者前期研究表明，黃芩苷、黃芩素聯(lián)合苯唑西林對臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有顯著的協(xié)同抗菌作用，通過抑制MRSA產(chǎn)生PBP2a逆轉(zhuǎn)對苯唑西林的高度耐藥[1]。黃芩水煎液對銅綠假單胞菌生物膜也具有清除作用。屬假單胞菌屬的銅綠假單胞菌是慢性呼吸道感染常見的致病菌，生成生物膜后具備較高的耐藥能力和可播散的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為對抗菌藥物產(chǎn)生滲透障礙、不敏感及特殊生理狀態(tài)，在院內(nèi)獲得性感染中檢出率最高，引起的生物膜感染是目前醫(yī)療器械相關(guān)感染的主要原因[2]。本研究目的在于確證黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用，為臨床有效治療細(xì)菌生物膜感染提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SN3400NⅡ型掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；LRH-150-B型智能生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；MR23i型高速冷凍離心機(jī)（法國Jouan公司）；BL600型電子分析天平（德國Sartorius公司）；MIP-P型多點(diǎn)接種儀（日本Sakuma公司）；移液器（芬蘭Finnpipette公司）。

1.2 試藥

黃芩苷、黃芩素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為375756、465119）；阿奇霉素（東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠，批號：081213014）；酵母提取物、胰蛋白胨（上海生物工程有限公司，批號分別為0701B02、218-171214PBAC-T）；戊二醛、無水乙醇和氯化鈉為分析純。

1.3 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株：銅綠假單胞菌X140（分離自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床標(biāo)本）；質(zhì)控菌株：ATCC 27853（中國藥品生物制品檢定所）。

2 方法

2.1 抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用瓊脂平皿二倍稀釋法測定阿奇霉素、黃芩苷、黃芩素的MIC[1]。質(zhì)量控制采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI（2006）推薦標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

2.2 細(xì)菌生物膜的鑒定、觀察

按文獻(xiàn)方法[3]復(fù)制生物膜的體外模型，采用SEM觀察生物膜形成情況。將LB瓊脂平板轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌X140過夜。即挑單菌落接種于10 mL LB肉湯中，37℃下恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液以10 000 r·min-1離心10 min，調(diào)整細(xì)菌數(shù)約為5×108cfu·mL-1，將菌液1 mL、LB肉湯4 mL加入6孔板，同時(shí)加入已消毒處理的蓋玻片，37℃恒溫培養(yǎng)。于24 h取出蓋玻片，經(jīng)無菌生理鹽水沖洗去掉浮游菌，用pH7.4的PBS漂洗3次后用2.5%戊二醛固定，再依次用50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每次均為10 min，待乙醇揮發(fā)后，真空條件下鍍金粉，在電壓15.0 kV、6 000倍放大倍數(shù)下觀察有無細(xì)菌黏附，此后每24 h更換LB肉湯，直至觀察生物膜形成。

2.3 黃芩苷、黃芩素、阿奇霉素對銅綠假單胞菌黏附情況及生物膜形成的觀察

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照、黃芩苷、黃芩素和阿奇霉素組，每組4份標(biāo)本。在制備生物膜的同時(shí)加入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度的黃芩苷、黃芩素和阿奇霉素，37℃培養(yǎng)，每日更換含藥LB肉湯，培養(yǎng)7 d，每組取3份標(biāo)本以連續(xù)稀釋法計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。另每組取1份按上述方法以SEM觀察銅綠單胞菌生物膜形成情況。

2.4 黃芩苷、黃芩素對早期和成熟生物膜的作用觀察

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照、阿奇霉素、黃芩苷和黃芩素組，于LB肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)，每日更換LB肉湯。采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，并按上述方法以SEM觀察。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。

3 結(jié)果

3.1 阿奇霉素、黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌X140的MIC

阿奇霉素、黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌X140的MIC見表1（表中PAE140代表銅綠假單孢菌X140）。

表1 阿奇霉素、黃芩苷、黃芩素對銅綠假單胞菌X140的MICTab 1 MIC of azithromycin，baicalin and baicalein against pseudomonas aeruginosa X140

3.2 生物膜載體表面的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

對空白對照、黃芩苷、黃芩素和阿奇霉素組載體表面的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別為（209.7±10.02）×104、（122.0±11.27）×104、（117.7±6.66）×104、（119.3±6.66）×104cfu·mL-1。實(shí)驗(yàn)組比空白對照組顯著減少（P＜0.01），而實(shí)驗(yàn)組之間則沒有明顯差異（P＞0.05）。

3.3 SEM觀察結(jié)果

通過SEM觀察可見，培養(yǎng)3 d后早期生物膜形成，載體表面有大量的銅綠假單胞菌黏附，連接成片，見多聚物的分泌，呈膜狀包裹的典型生物膜性狀。7 d后成熟生物膜表面多聚物的分泌量較培養(yǎng)3 d有明顯增加，并連成大片生物膜。

生物膜形成前加入黃芩苷、黃芩素、阿奇霉素干預(yù)，培養(yǎng)7 d后，SEM觀察黃芩苷、黃芩素、阿奇霉素組的結(jié)果相似：載體表面散在黏附著少量的銅綠假單胞菌，菌量比空白對照組明顯減少，多聚物的分泌也不明顯，細(xì)菌未表現(xiàn)出緊密黏附的狀態(tài)，幾乎未見生物膜形成。生物膜形成早期加入黃芩苷、黃芩素干預(yù)后SEM觀察可見少量細(xì)菌散在地黏附在載體表面，多聚物的分泌不明顯，幾乎未見生物膜形成。而當(dāng)生物膜完全形成后加入黃芩苷、黃芩素作用24 h后，SEM觀察可見一定量銅綠假單胞菌黏附，多聚物的分泌量明顯增多，與空白對照組比較減少明顯，未形成大片的生物膜。SEM觀察結(jié)果表明，黃芩苷、黃芩素能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，且對早期生物膜形成的抑制作用比對成熟生物膜的抑制作用強(qiáng)。SEM觀察結(jié)果見圖1。

4 討論

黃芩在臨床上已廣泛應(yīng)用于上呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等治療，其活性成分黃酮類化合物（黃芩苷、黃芩素等）對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和螺旋體等均具有抑制作用。目前有研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類藥物在體外亞-MIC下顯示了對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用[4]，而亞-MIC下黃芩水煎液對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用與大環(huán)內(nèi)酯類相類似。本研究以阿奇霉素作為陽性對照，對生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明黃芩苷、黃芩素能抑制生物膜的形成。

圖1 SEM觀察結(jié)果A.載體在懸液中培養(yǎng)3 d（早期生物膜）；B.載體在懸液中培養(yǎng)7 d（成熟生物膜）；C.載體在含32 μg·mL-1黃芩苷的懸液中培養(yǎng)7 d；D.載體在含2 μg·mL-1黃芩素的懸液中培養(yǎng)7 d；E.載體在含1 μg·mL-1阿奇霉素的懸液中培養(yǎng)7 d；F.32 μg·mL-1黃芩苷對早期生物膜作用24 h；G.2 μg·mL-1黃芩素對早期生物膜作用24 h；H.32 μg·mL-1黃芩苷對成熟生物膜作用24 h；I.2 μg·mL-1黃芩素對成熟生物膜作用24 hFig 1 Results of SEMA.the vector in culture solution for 3 days（prophase biofilms）；B.the vector in culture solution for 7 days（maturate biofilms）；C.The vector was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 7 days；D.the vector was treated by baicalein with the concentration of 2 μ g·mL-1for 7 days；E.the vector was treated by azithromycin with the concentration of 32 μg·mL-1for 7 days；F.the prophase biofilms was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 24 h；G.the prophase biofilms was treated by baicalein with the concentration of 2 μg·mL-1for 24 h；H.the maturate biofilms was treated by baicalin with the concentration of 32 μg·mL-1for 24 h；I.the maturate biofilms was treated by baicalein with the concentration of 2 μg·mL-1for 24 h

SEM觀察結(jié)果顯示，黃芩苷、黃芩素體外能抑制銅綠假單胞菌對固體表面的黏附能力，顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，還能破壞銅綠假單胞菌已形成的早期和成熟期生物膜；且黃芩苷、黃芩素對生物膜的破壞效果與大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素相似。從而證明黃芩苷、黃芩素與阿奇霉素對銅綠假單胞菌早期生物膜的形成具有強(qiáng)大的抑制作用，對成熟生物膜的抑制作用則較弱。結(jié)合前期研究[1]可知，黃芩苷、黃芩素具有逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥的作用，其機(jī)制可能與抑制PBP2a的表達(dá)有關(guān)。而黃芩一旦與某些抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用就可以明顯提高這些抗菌藥物的殺菌效力，體外研究也證實(shí)中藥可以促進(jìn)抗生素對細(xì)菌的殺傷作用[5]，這些研究結(jié)果進(jìn)一步促進(jìn)了清熱燥濕（解毒）中藥的臨床研究和應(yīng)用，形成了中藥“抗菌增敏”的概念。這也給筆者對于臨床上使用黃芩對銅綠假單胞菌生物膜感染的防治提供了理論依據(jù)。但生物膜畢竟只是細(xì)菌耐藥的機(jī)制之一，要完全弄清黃芩苷、黃芩素的“抗菌增敏”效應(yīng)，還有待進(jìn)一步的研究。

[1]陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究[J].中國藥房，2008，19（9）：644.

[2]Coster T JW，Stewart PS，Greenberg EP.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections[J].Science，1999，284（5 418）：1 318.

[3]徐志豪，劉富光，王選錠，等.紅霉素、磷霉素對銅綠假單胞菌生物被膜體外作用的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（6）：342.

[4]張文元，楊亞冬，唐 靚.十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類對細(xì)菌生物被膜形成的影響及對環(huán)丙沙星的增效作用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（11）：1 288.

[5]林 杉，李仲昆，趙 云，等.雙黃連粉針與頭孢唑林伍用效果機(jī)理研究[J].中國藥房，2000，11（1）：18.

Study on Inhibition Effect of Baicalin and Baicalein on the Formation of PseudomonasAeruginosa Biofilm

XIE Lin-li，ZHOU Mi，CHEN Yong-chuan，XIONG Li-rong，XIA Pei-yuan（Dept.of Pharmacy，Southwest Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To investigate the destructive effect of baicalin and baicalein on the formation of pseudomonas aeruginosa biofilm.METHODS：X140，a pseudomonas aeruginosa，was selected for investigation.After the biofilm was treated by baicalin or baicalein with the concentration of 32 μg·mL-1and 2 μg·mL-1，the numbers of viable bacteria were measured by serial dilution using azithromycin as control.The variations were observed under scanning electronic microscope（SEM）.RESULTS：Both of the baicalin and baicalein with the concentration of 32 μg·mL-1and 2 μg·mL-1could inhibit the adherence of pseudomonas aeruginosa significantly and the formation of biofilm（P＜0.01）.CONCLUSION：Baicalin and baicalein can inhibit the adherence of pseudomonas aeruginosa and the formation of biofilm.

Biofilm；Baicalin；Baicalein；Pseudomonas aeruginosa

R283；R97

A

1001-0408（2010）39-3651-03

2009-11-03

2010-03-12）