謝文利，朱 江，萬(wàn)宗明，趙艷威（武警醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津市 300162）

糙蘇素的抗腫瘤作用及機(jī)制研究Δ

謝文利＊，朱 江，萬(wàn)宗明，趙艷威（武警醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津市 300162）

目的：研究糙蘇素的抗腫瘤作用及其對(duì)端粒酶活性和細(xì)胞周期的影響。方法：采用血清藥理學(xué)與體內(nèi)、外抑瘤實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，MTT法檢測(cè)糙蘇素含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞增殖的抑制作用，聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)K562細(xì)胞在糙蘇素作用后端粒酶活性的變化，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的改變；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用小鼠肝癌H22細(xì)胞株接種小鼠，連續(xù)給藥14 d，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果：糙蘇素含藥血清在10%～50%劑量范圍內(nèi)對(duì)K562細(xì)胞有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）；糙蘇素作用后端粒酶活性出現(xiàn)抑制，且各給藥組隨糙蘇素濃度增加抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.01），同一濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）；K562細(xì)胞的DNA合成后期/分裂期（G2/M）細(xì)胞含量顯著增高（P＜0.01）；糙蘇素（2.5、5、10 mg·kg-1）灌胃能顯著抑制小鼠移植性肝癌H22細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)論：糙蘇素具有抗腫瘤作用，其作用是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性而實(shí)現(xiàn)的。

糙蘇素；端粒酶；腫瘤細(xì)胞

糙蘇素（phlomio1）為唇形科（Labiete）糙蘇屬（Phlomis）植物螃蟹甲中的一種環(huán)烯醚萜苯類成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，植物中許多環(huán)烯醚萜苷類化合物有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等活性[1]，因此我們推測(cè)糙蘇素可能具有抗腫瘤作用。端粒酶的激活可以維持端粒的長(zhǎng)度并使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力而逃避死亡。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)絕大部分腫瘤都呈端粒酶陽(yáng)性，提示端粒酶在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。本文對(duì)糙蘇素的抗腫瘤作用及對(duì)端粒酶和細(xì)胞周期的影響進(jìn)行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DG3022A型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ProfileⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Coulter公司）；LDZ4型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試藥

糙蘇素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100641-200401）；端粒酶-PCR-ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Boehringer Mannheim公司，批號(hào)：20071105）；MTT（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：071055）。

1.3 動(dòng)物、細(xì)胞株及動(dòng)物瘤株

健康ICR小鼠40只，♂♀兼半，體質(zhì)量（21±4.6）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0003）。人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。動(dòng)物移植性腫瘤小鼠H22細(xì)胞，由天津醫(yī)藥科學(xué)研究所提供。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)血清制備

按文獻(xiàn)方法[2]制備2組實(shí)驗(yàn)血清，即無(wú)藥血清和含藥血清組。每組取大鼠6只，♂♀兼半。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水18 h，含藥血清組ig糙蘇素溶液，劑量為100 mg·kg-1；無(wú)藥血清組ig等容積生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。末次給藥2 h后乙醚麻醉，眼眶靜脈無(wú)菌采血。收集的全血以2 500 r·min-1離心15 min，取血清，合并同組血清后，經(jīng)56℃水浴、30 min滅活，放入－20℃冰箱中貯藏，備用。

2.2 糙蘇素含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的抑制作用

方法[3]進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，消化并計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)·mL-1。接種于96孔板上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為空白對(duì)照（50%）和糙蘇素含藥血清高、中、低濃度（50%、20%、10%）組。每孔加入100 μL相應(yīng)濃度藥物或空白培養(yǎng)基，做4復(fù)孔。相同條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前4 h加入20 mL MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，離心去除上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，振蕩器混勻，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度（OD）值。

2.3 糙蘇素對(duì)小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)抑制作用

采用常規(guī)方法[4]，分別設(shè)對(duì)照（ig，等量生理鹽水）、環(huán)磷酰胺（ip，100 mg·kg-1）和糙蘇素高、中、低劑量（ig，10、5、2.5 mg·kg-1）組。各組于接種次日開(kāi)始每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。

2.4 端粒酶活性測(cè)定

分組同“2.2”項(xiàng)下方法操作。K562細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入濃度為10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用48、72 h，空白對(duì)照組加等量培養(yǎng)液。分別收集不同濃度糙蘇素作用后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞（105個(gè)），加入500μL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，4℃下3 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀加適量細(xì)胞裂解液懸浮，置冰浴30 min，4℃下14 000 r·min-1離心20 min，吸取上清于－70℃貯藏，備用。采用Kim NW等[5]的改良聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定，操作步驟均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 細(xì)胞周期分析

參考文獻(xiàn)方法[6]分別收集10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用72 h和未處理的K562細(xì)胞，用PBS清洗2次，再用預(yù)冷無(wú)水乙醇700 mL·L-1固定，4℃貯藏。檢測(cè)前離心去除乙醇，碘化丙啶染色20 min，于流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期中不同時(shí)相的細(xì)胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析和q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 糙蘇素含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的抑制作用

糙蘇素對(duì)K562細(xì)胞均具有抑制作用，且在濃度為10%～50%范圍內(nèi)抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.01或P＜0.05）。糙蘇素含藥血清對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)表1。

表1 糙蘇素含藥血清對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用（±s，n＝4）Tab 1 Inhibitory effect of serum containing phlomiol on the growth of K562 tumor cell（±s，n＝4）

表1 糙蘇素含藥血清對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用（±s，n＝4）Tab 1 Inhibitory effect of serum containing phlomiol on the growth of K562 tumor cell（±s，n＝4）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對(duì)照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組OD值0.83±0.11 0.62±0.17＊0.43±0.12＊＊0.25±0.03＊＊0.21±0.03＊＊

3.2 糙蘇素對(duì)小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)抑制作用

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可觀察到糙蘇素高、中、低劑量和環(huán)磷酰胺組小鼠飲食飲水正常、皮毛柔順光滑、活動(dòng)自如，生活質(zhì)量明顯優(yōu)于對(duì)照組小鼠。各組間小鼠體質(zhì)量增加無(wú)顯著差異（P＞0.05）。同時(shí)，高、中、低劑量糙蘇素對(duì)腫瘤具有抑制作用（P＜0.01或P＜0.05），抑制強(qiáng)度呈劑量依賴性。糙蘇素對(duì)小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)抑制作用見(jiàn)表2。

3.3 糙蘇素含藥血清對(duì)端粒酶活性的影響

10%的糙蘇素含藥血清作用48 h后端粒酶活性出現(xiàn)抑制，且各給藥組隨糙蘇素濃度增加抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；同一濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。糙蘇素含藥血清對(duì)端粒酶活性的影響見(jiàn)表3。

3.4 糙蘇素含藥血清對(duì)細(xì)胞周期的影響

采用10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用72h后的K562細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞數(shù)所占百分比均明顯提高（P＜0.01或P＜0.05），20%糙蘇素含藥血清組與50%糙蘇素含藥血清組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。糙蘇素含藥血清對(duì)細(xì)胞周期的影響見(jiàn)表4。

表2 糙蘇素對(duì)小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)抑制作用（±s，n＝8）Tab 2 Inhibitory effect of phlomiol on the growth of mice hepatic cancer H22 cell（±s，n＝8）

表2 糙蘇素對(duì)小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)抑制作用（±s，n＝8）Tab 2 Inhibitory effect of phlomiol on the growth of mice hepatic cancer H22 cell（±s，n＝8）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

抑制率/%組別空白對(duì)照組糙蘇素低劑量組糙蘇素中劑量組糙蘇素高劑量組環(huán)磷酰胺組體質(zhì)量增加/g 4.6±1.5 4.8±1.2 4.0±1.4 4.3±1.8 3.1±0.6瘤重/g 1.77±0.35 1.15±0.23＊0.83±.015＊＊0.45±0.12＊＊0.28±0.05＊＊35.0 53.1 74.5 84.1

表3 糙蘇素含藥血清對(duì)端粒酶活性的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of serum containing phlomiol on the activity of telomeras（e±s，n＝4）

表3 糙蘇素含藥血清對(duì)端粒酶活性的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of serum containing phlomiol on the activity of telomeras（e±s，n＝4）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對(duì)照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組OD值48 h 1.70±0.09 0.71±0.11＊0.57±0.05＊＊0.32±0.06＊＊0.17±0.03＊＊72 h 1.51±0.02 0.66 ±0.03＊＊0.47±0.02＊＊0.27±0.03＊＊0.25±0.03＊＊

表4 糙蘇素含藥血清對(duì)細(xì)胞周期的影響（±s，n＝4）Tab 4 Effect of serum containing phlomiol on cell cycle（±s，n＝4）

表4 糙蘇素含藥血清對(duì)細(xì)胞周期的影響（±s，n＝4）Tab 4 Effect of serum containing phlomiol on cell cycle（±s，n＝4）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對(duì)照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組K562細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞數(shù)所占百分比/%19.1±1.5 43.3±4.5＊62.5±6.4＊＊58.1±4.2＊＊60.9±3.2＊＊

4 討論

糙蘇屬植物在全球約有100種以上，在我國(guó)，糙蘇屬植物多作藥用，中醫(yī)學(xué)、民族醫(yī)學(xué)的藥性理論認(rèn)為本屬植物具有理氣健脾、清熱解毒、消腫止痛、祛風(fēng)活絡(luò)、活血調(diào)經(jīng)、止咳化痰之功效，廣泛用于治療消化不良、筋骨疼痛、瘡疥腫毒、咳嗽痰多、感冒發(fā)熱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺炎、支氣管炎等疾病[7]。糙蘇素為糙蘇屬植物螃蟹甲中的一種環(huán)烯醚萜類成分，該成分很可能就是糙蘇屬植物治療“瘡疥腫毒”的主要藥理基礎(chǔ)，即抗腫瘤作用的主要成分[8]。

筆者采用體內(nèi)、體外2種方法對(duì)糙蘇素的抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步研究，其中體外實(shí)驗(yàn)采用了血清藥理學(xué)的方法，它排除了傳統(tǒng)中藥體外實(shí)驗(yàn)中中藥本身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，又能反映藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程及其作用結(jié)果[9]。近年來(lái)，中藥抗腫瘤分子機(jī)制的研究主要集中在誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)分化、端粒酶抑制、微管蛋白活性抑制等方面，筆者選擇的是端粒酶活性測(cè)定及細(xì)胞周期分析的方法。端粒酶特異性地表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞，又是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖能力所必需，那么，理論上端粒酶的抑制可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停止或死亡[10]。

研究結(jié)果表明，糙蘇素含藥血清體外可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，具有抑制K562細(xì)胞端粒酶活性的作用，而且該作用具有時(shí)間和劑量依賴性；采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析表明，端粒酶活性被抑制72 h后，K562細(xì)胞增殖也出現(xiàn)障礙，將49.3%以上的K562細(xì)胞阻滯在G2/M期，結(jié)果表明，端粒酶活性依賴于細(xì)胞所處的分裂周期的時(shí)相。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，荷瘤小鼠ig糙蘇素可以使H22腫瘤顯著抑制。總之，糙蘇素體內(nèi)、外均有抗腫瘤作用，糙蘇素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和細(xì)胞周期阻滯作用可能與端粒酶抑制有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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Anti-tumor Effect of Phlomiol and Its Mechanism Study

XIE Wen-li，ZHU Jiang，WAN Zong-ming，ZHAO Yan-wei（Dept.of Pharmacology，Medical College of Chinese Armed Police Force，Tianjin 300162，China）

OBJECTIVE：To study the anti-tumor effect of phlomiol，and its influences on the activity of telomerase and cells phases.METHODS：Serologic pharmacological method，in vivo and in vitro anti-tumor experiments were adopted in the study.The inhibition effect of serum containing phlomiol on the proliferation of K562 tumor cells in vitro were detected by MTT method.The activity of telomerase in K562 tumor cell was determined by TRAP-PCR-ELISA.Flow cytometry was used to analyze the change of cell cycle.In vivo experiment，mice was inoculated with hepatic cancer H22 cells and the mice were orally administrated with phlomiol for 14 days.The inhibition rate of tumor was caculated.RESULTS：Serum containing 10%～50%phlomiol inhibited the proliferation of K562 tumor cells in vitro in dose-dependent manner（P＜0.05）.Phlomiol inhibited the activity of telomerase in K562 tumor cells.The inhibition effect was in dose-dependent manner（P＜0.01）.Meanwhile the inhibition effect increased gradually when the action time extended in the same dose of phlomiol group（P＜0.05）.The content of cell in K562 tumor cells were markedly increased in G2/M phase（P＜0.01）.Phlomiol（2.5，5，10 mg·kg-1，i.g）inhibited the growth of implanted hepatic cancer H22 cells signiflcantly.CONCLUSION：The anti-tumor activity of phlomiol is performed by inhibiting the activity of telomerase in tumor cells.

Phlomiol；Telomerase；Tumor cells

R285；R94

A

1001-0408（2010）39-3653-03

2009-12-07

2010-04-18）