周小莉，李榮亨（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市 400016）

復(fù)元膠囊對硝普鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期作用的實驗研究

周小莉＊，李榮亨#（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶市 400016）

目的：研究復(fù)元膠囊含藥血清對硝普鈉（SNP）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的作用。方法：雄性3周齡SD大鼠，用于分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞；雄性成年SD大鼠，用于制備含藥血清。將第2代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行分組實驗。透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期百分率及細(xì)胞凋亡率，硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)液中NO含量。結(jié)果：復(fù)元膠囊含藥血清可使SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞處于G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加（P＜0.05，P＜0.01）；可使細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），培養(yǎng)上清中NO含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：復(fù)元膠囊含藥血清能顯著降低SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并降低培養(yǎng)液中NO的含量，這可能是復(fù)元膠囊防治骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制之一。

復(fù)元膠囊；軟骨細(xì)胞；中藥；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；一氧化氮

關(guān)節(jié)軟骨退行性病變是骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，近年研究表明，隨著增齡，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞密度顯著降低，軟骨變性、丟失，繼之鄰近軟骨增生、骨化而形成骨關(guān)節(jié)病變，故軟骨細(xì)胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨退行性改變過程中起著重要作用[1，2]。復(fù)元膠囊是臨床上長期用于治療OA有明顯療效的中藥復(fù)方醫(yī)院制劑，由人參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當(dāng)歸、枸杞子等組成，具有補益肝腎、益氣活血之功效，對氣虛血瘀證患者癥狀、血液流變學(xué)有改善作用，可緩解疼痛，改善OA關(guān)節(jié)功能[3]，但其作用機制尚不十分清楚。本研究采用透射電鏡、流式細(xì)胞儀及硝酸還原酶法觀察復(fù)元膠囊含藥血清對硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及培養(yǎng)上清中一氧化氮（Nitric oxide，NO）水平的影響，探討其防治OA的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2A型凈化工作臺（重慶匯誠空調(diào)凈化設(shè)備制造公司）；2001-13型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海常思工貿(mào)有限公司）；IX-700型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀（美國Becton Dickinson公司）；HITACHI-7500型透射電鏡（日本Hitachi公司）；生物分光光度計（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

復(fù)元膠囊委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊，僅供實驗使用（批號：090312）；SNP（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：H111021635）；DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基（FD培養(yǎng)基）、胎牛血清（美國Hyclone公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；碘化丙錠（PI）染色劑（深圳晶美生物工程有限公司）；NO硝酸還原酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

3周齡SD大鼠10只，♂，體質(zhì)量40～60 g；成年SD大鼠30只，♂，體質(zhì)量200～250 g，均由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（渝）2002007）。

2 方法

2.1 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代[4]

將3周齡SD大鼠斷頸處死后，無菌條件下分離出股骨頭軟骨，盡量剔除周圍組織，浸入含青霉素和鏈霉素的雙抗水中漂洗3次，浸入FD培養(yǎng)基中漂洗3次，再次清除軟骨周圍附帶組織，將軟骨剪成1 mm3大小，移入0.25%胰蛋白酶中，放入37℃水浴箱中消化30 min，胎牛血清終止消化，PBS緩沖液清洗2遍，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶中，放入37℃水浴箱消化4 h成絮狀，其間每30 min輕輕搖蕩1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS緩沖液清洗2遍，加入含15%胎牛血清FD培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。原代細(xì)胞長滿80%后傳代培養(yǎng)。用于實驗的軟骨細(xì)胞為第2代的傳代細(xì)胞。

2.2 含藥血清的制備

成年SD大鼠30只，隨機分成2組，即復(fù)元膠囊組（20只）、空白組（10只）。復(fù)元膠囊組按Meeh-Rubner公式給予等效劑量10倍量藥物，充分溶于生理鹽水；空白組給予等劑量的生理鹽水，ig給藥，每天2次，連續(xù)3 d。末次ig后2 h腹主動脈取血，4 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心20 min，取上清，經(jīng)0.22μm抽濾器除菌后，分裝，－20℃貯藏，備用。

2.3 分組

選用第2代軟骨細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，用不含血清的FD培養(yǎng)基“饑餓”培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。分為空白組（FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）、模型組（2 mmol·L-1SNP+FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）、10%空白血清組（2 mmol·L-1SNP+10%空白血清+FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）、5%復(fù)元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+5%復(fù)元膠囊含藥血清+FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）、10%復(fù)元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+10%復(fù)元膠囊含藥血清+FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）、20%復(fù)元膠囊血清組（2 mmol·L-1SNP+20%復(fù)元膠囊含藥血清+FD培養(yǎng)基培養(yǎng)）。

2.4 透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)

按“2.3”項下進(jìn)行分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，用胰酶將細(xì)胞消化后收集于離心管。在4℃條件下以2 000 r·min-1離心成細(xì)胞團塊，用2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨再固定1.5 h，經(jīng)梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，電子染色，透射電鏡下觀察。

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

收集細(xì)胞（酶消化法），PBS洗滌1遍，加70%乙醇，振蕩（4℃貯藏）。上機前離心去除固定液，PBS洗2遍，加1 mL PBS重懸細(xì)胞，加20 μL RNAse（10 mg·mL-1）使之終濃度為200 μg·mL-1，37 ℃放置30 min以上。加入碘化丙啶，使其終濃度為50 μg·mL-1，避光30 min；300目尼龍網(wǎng)過濾，于流式細(xì)胞儀檢測，計數(shù)10 000個細(xì)胞，分析細(xì)胞周期。

2.6 流式細(xì)胞分析法檢測軟骨細(xì)胞凋亡

用胰酶將細(xì)胞消化后，收集于離心管。在4℃條件下以2 000 r·min-1離心成細(xì)胞團塊，按AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用FACS Aria流式細(xì)胞分析儀檢測，每個樣本檢測計數(shù)的細(xì)胞數(shù)量均固定為10 000個，應(yīng)用CEL LQuest軟件獲取、分析輸出實驗數(shù)據(jù)。

2.7 硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)血清中NO濃度

收集各組培養(yǎng)液，采用硝酸還原酶法檢測血清中NO濃度，操作按說明書進(jìn)行，并按照試劑盒說明書推薦的公式計算NO含量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞形態(tài)

原代軟骨細(xì)胞接種時為圓形懸浮狀態(tài)。48 h后，細(xì)胞大部分貼壁，呈圓形或橢圓形，體積較小。經(jīng)Ⅱ型膠原細(xì)胞免疫組化鑒定為軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 軟骨細(xì)胞形態(tài)A.倒置顯微鏡（×100）；B.SP染色（×200）Fig 1 Morphology of chondrocyteA.inverted microscope（×100）；B.SP（×200）

3.2 透射電鏡下對軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

正常軟骨細(xì)胞核完整，核膜清晰，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀排列，線粒體散在分布，細(xì)胞表面有許多微絨毛突起。早期凋亡細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞表面的微絨毛明顯減少，甚至消失，細(xì)胞漿致密，細(xì)胞器完整，核染色質(zhì)濃縮，集聚于核膜下；中晚期凋亡細(xì)胞體積明顯縮小，核膜發(fā)生皺褶，胞質(zhì)密度增高，有典型的凋亡小體，內(nèi)有細(xì)胞器，細(xì)胞周圍可見脫落的凋亡小體；壞死細(xì)胞腫脹，不完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見水泡，甚至細(xì)胞溶解，無完整的細(xì)胞器。模型組軟骨細(xì)胞主要為凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，可見少量正常細(xì)胞；中藥組以正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞為主。

3.3 復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞周期的影響

與模型組和空白組血清比較，復(fù)元膠囊血清處理后的細(xì)胞處于G0/G1期的百分比減少，S及G2/M期的百分比增加，增殖指數(shù)（PI）顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。3個濃度復(fù)元膠囊血清，以10%的復(fù)原膠囊血清作用最顯著。復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞周期的影響見表1。

圖2 軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（TEM×6 000）A.正常細(xì)胞；B.早期凋亡細(xì)胞；C.中晚期凋亡細(xì)胞；D.壞死細(xì)胞Fig 2 The ultrastructure of chondrocyte（TEM×6 000）A.normal cells；B.apoptosis cells in the early stage；C.apoptosis cells in advanced stage；D.necrotic cells

表1 復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞周期的影響（±s）Tab 1 Effects of serum containing Fuyuan capsule on cell cycle progression of chondrocyte（±s）

表1 復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞周期的影響（±s）Tab 1 Effects of serum containing Fuyuan capsule on cell cycle progression of chondrocyte（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組10%空白血清組5%復(fù)元膠囊血清組10%復(fù)元膠囊血清組20%復(fù)元膠囊血清組PI/%15.81±1.51 6.62±1.14＊20.95±1.40#22.61±1.23＊＊#29.20±1.70＊#23.10±0.74＊#n 5 5 5 5 5 5 G0/G1/%85.18±1.58 93.40±1.14＊80.05±0.71#77.39±1.23＊＊#70.60±1.38＊#76.50±1.21＊##S/%5.30±0.63 3.50±0.35＊＊10.30±0.75#11.57±0.96#17.42±0.42＊#14.21±1.10＊#G2/M/%9.70±0.15 3.31±0.17＊＊9.90±0.65#11.20±0.84#11.74±1.38＊#9.10±0.39＊#

3.4 復(fù)元膠囊含藥血清對SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及培養(yǎng)液中NO含量的影響

與模型組血清比較，復(fù)元膠囊含藥血清組細(xì)胞凋亡率顯著降低，培養(yǎng)液中NO含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。3個濃度復(fù)元膠囊血清，以10%、20%的血清作用最顯著，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡及培養(yǎng)液中NO含量的影響見表2。

4 討論

OA在祖國醫(yī)學(xué)屬于“痹證”、“骨痹”范疇，腎元虧虛、肝血不足、氣虛血瘀是導(dǎo)致本病的根本內(nèi)因。中醫(yī)藥治療OA有著悠久的歷史，因其效果顯著、副作用小、適合長期治療而獨具優(yōu)勢。復(fù)元膠囊是臨床上長期用于治療OA有明顯療效的中藥復(fù)方制劑，筆者前期工作發(fā)現(xiàn)，復(fù)元膠囊含藥血清可促進(jìn)正常軟骨細(xì)胞的增殖、DNA及Ⅱ型膠原合成[5]。本實驗從復(fù)元膠囊對軟骨細(xì)胞凋亡的角度進(jìn)一步探討其作用機制。

OA是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，軟骨細(xì)胞過度凋亡在其發(fā)病過程中起著重要作用。本研究結(jié)果表明，經(jīng)SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞在透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài)，包括細(xì)胞體積縮小、染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，復(fù)元膠囊含藥血清能降低軟骨細(xì)胞凋亡率，與模型組及空白血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)元膠囊含藥血清能抑制軟骨細(xì)胞的過度凋亡，可能是復(fù)元膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的重要機制之一。

表2 復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡及培養(yǎng)液中NO含量的影響（±s）Tab 2 Effects of serum containing Fuyuan capsule on the SNP-induced apoptosis of chondrocytes and NO in the culture supernatant（±s）

表2 復(fù)元膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡及培養(yǎng)液中NO含量的影響（±s）Tab 2 Effects of serum containing Fuyuan capsule on the SNP-induced apoptosis of chondrocytes and NO in the culture supernatant（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組10%空白血清組5%復(fù)元膠囊血清組10%復(fù)元膠囊血清組20%復(fù)元膠囊血清組n 5 5 5 5 5 5細(xì)胞凋亡率/%1.94±0.15 39.73±1.10＊＊36.23±0.59##34.82±1.20＊＊##29.47±1.33＊#30.28±1.05＊#NO含量/μmol·L-1 26.53±1.58 153.11±5.08＊＊122.12±4.41#114.46±7.34#81.03±7.87＊#85.93±3.99＊#

細(xì)胞周期與細(xì)胞中DNA含量密切相關(guān)，DNA含量隨著細(xì)胞周期的各期而發(fā)生變化。細(xì)胞的周期分布能夠反映細(xì)胞增殖的具體過程。PI是S期與G2期DNA含量之和同S期、G2期及G1期DNA含量之和的比值，它與S期百分比是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)[6]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)元膠囊血清處理后的細(xì)胞處于G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加，PI明顯增加，表明復(fù)元膠囊能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

用NO供體SNP誘導(dǎo)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型已成為一種常用的實驗手段[7]。研究發(fā)現(xiàn)SNP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能存在以下關(guān)系：低濃度時抑制細(xì)胞凋亡，高濃度時引起細(xì)胞凋亡，過高濃度時引起細(xì)胞壞死[8]。而OA關(guān)節(jié)中NO抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，使關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞數(shù)量減少，關(guān)節(jié)修復(fù)功能下降[9]。所以，通過抑制NO的產(chǎn)生來抑制軟骨細(xì)胞的過度凋亡可能是一條治療OA的途徑。本研究結(jié)果顯示，2 mmol·L-1濃度的SNP作用于軟骨細(xì)胞48 h能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡率升高，伴隨有培養(yǎng)液中NO濃度增加。當(dāng)筆者用復(fù)元膠囊含藥血清干預(yù)后，軟骨細(xì)胞凋亡率明顯降低并伴有培養(yǎng)液中NO含量降低，提示復(fù)元膠囊可能通過降低NO含量而抑制軟骨細(xì)胞過度凋亡。

本研究初步揭示了復(fù)元膠囊含藥血清抑制軟骨細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞周期的作用，但只是在細(xì)胞水平上的闡述。至于其有效成分是如何抑制細(xì)胞凋亡，它作用于細(xì)胞膜上的何種受體，以及信號如何在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行傳導(dǎo)，是需要進(jìn)一步研究的問題。

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Effects of Fuyuan Capsule on SNP-induced Apoptosis of Chondrocyte and Cell Cycle Progression

ZHOU Xiao-li，LI Rong-heng（Dept.of Integrated Traditional and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To study the effects of the serum containing Fuyuan capsule on sodium nitroprusside（SNP）-induced apoptosis of chondrocyte in vitro and cell cycle progression.METHODS：The chondrocyte of 3-week-old male SD rats were separated and cultivated.Male SD rats were included in the preparation of serum containing Fuyuan capsule.The second generation of chondrocyte was involved in experiment.TEM and flow cytometer were adopted to observe ultrastructure of apoptotic chondrocyte and detect cell cycle progression and apoptosis rate.NO examination adopted nitrare reductase method.RESULTS：The serum containing Fuyan capsule could significantly decrease the percentage of SNP-induced apoptosis in G0/G1phase and increase percentage in S phase and G2/M phase（P＜0.05，P＜0.01）.The apoptosis of chondrocyte was decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.The concentration of NO in the culture supernatants was reduces significantly（P＜0.05）.CONCLUSION：The serum containing Fuyuan capsule could promote proliferation of chondrocyte，inhibit SNP-induced apoptosis of chondrocyte，and reduce the concentration of NO in the culture supernatants.It is an important mechanism of Fuyuan capsule preventing osteoarthritis.

Fuyuan capsule；Chondrocyte；Traditional Chinese medicine；Apoptosis；Cell cycle；NO

R285.5；R97

A

1001-0408（2010）39-3661-04

2009-12-05

2010-04-12）