陳培麗，王申東，畢銘陽，胡斯，劉家應（1.上海市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海市 00040；.上海市兒童醫(yī)院藥劑科，上海市 00040；.上海市兒童醫(yī)院檢驗科，上海市 00040）

麥芪益肺合劑對哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影響及安全性研究

陳培麗1＊，王申東2，畢銘陽2，胡斯2，劉家應3（1.上海市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海市 200040；2.上海市兒童醫(yī)院藥劑科，上海市 200040；3.上海市兒童醫(yī)院檢驗科，上海市 200040）

目的：通過觀察麥芪益肺合劑對系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應性模型小鼠外周血T淋巴細胞的變化，探討其對輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2（Th1/Th2）平衡的影響及安全性。方法：1%卵蛋白（OVA）刺激復制哮喘模型小鼠，隨機分為正常、哮喘模型和麥芪益肺合劑組，采用流式細胞儀測定小鼠外周血（摘除眼球取血）細胞內(nèi)白細胞介素4（IL-4）及干擾素（IFN-γ）的表達。按最大給藥量對小鼠灌胃，對照組給予等量生理鹽水，觀察小鼠癥狀及體質(zhì)量改變。結果：模型小鼠表現(xiàn)出明顯非特異性炎癥反應征象，而麥芪益肺合劑組小鼠無明顯炎癥反應征象。與正常組比較，哮喘模型組小鼠IL-4明顯升高（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組小鼠Th1細胞表達明顯增強（P＜0.01）。以最大給藥劑量灌胃，麥芪益肺合劑組與正常組小鼠癥狀及體質(zhì)量無明顯改變（P＞0.05）。結果：麥芪益肺合劑對小鼠系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應性模型在激發(fā)期有干預作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平恒是其藥效作用機制之一。

麥芪益肺合劑；輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2；小鼠；哮喘；安全性

支氣管哮喘是兒童呼吸道疾病中的常見病、多發(fā)病，已成為全球性的社會衛(wèi)生問題，對兒童的健康構成了嚴重威脅。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，用于哮喘病的費用也逐步增加，誤工、誤學、心理障礙及生活質(zhì)量降低所造成的無形損失更是無法計算。在西醫(yī)對哮喘病的治療尚無“治本”措施的今天，中醫(yī)中藥“扶正固本”的治療方法無疑是調(diào)節(jié)患兒機體免疫能力的重要手段。本研究通過觀察系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應性模型小鼠白細胞介素4（IL-4）及干擾素（IFN-γ）細胞因子的表達狀況，研究上海市兒童醫(yī)院自制“麥芪益肺合劑”對哮喘Th1/Th2細胞失衡的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

單激光四色流式細胞儀（美國BD公司）；Turbo BOY N型霧化器（德國Pari公司）。

1.2 試藥

麥芪益肺合劑（主要成分：黃芪、麥冬、黨參、防風、五味子、烏梅、陳皮、甘草、白術、茯苓等）由上海市兒童醫(yī)院自制（批號：05090403，含量：8.32 g（生藥）·mL-1）；1%卵蛋白（OVA，上海伯澳生物科技公司，批號：070301）；細胞因子（抗IFN-γFITC、IL-4假單孢外毒素（PE））、細胞表面標記抗體（CD3PC5、CD8ECD）均購自美國Beckman Coulter公司；離子霉素、莫能霉素、佛波酯（PMA）等均購自美國Sigma公司。

1.3 動物

健康8周齡Balb/c小鼠18只，♀♂兼半，體質(zhì)量（21.02±1.46）g，由復旦大學動物實驗中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2002-0031）。

2 方法

2.1 系統(tǒng)性呼吸道變態(tài)反應性哮喘鼠模型的復制

小鼠致敏方法參照Mccusker C等[1]文獻報道，即實驗第0、7、14天分別ip 1%OVA抗原混懸液0.2 mL，第28天起用1%OVA超聲霧化吸入，每天20 min，連續(xù)7 d。。

2.2 分組及給藥

實驗分為3組，即正常（等容生理鹽水）、哮喘模型（等容生理鹽水）、麥芪益肺合劑（0.8 mL）組。ig給藥，每天1次，致敏前給藥。

2.3 流式細胞術檢測方法

用流式細胞儀檢測小鼠外周血（摘除眼球取血）IL-4及IFN-γ，應用雙管標記檢測法，即采用CD4、CD8和IFN-γ FITC三色標記一管，用于檢測TH1細胞，CD4、CD8和IL-4 PE三色標記一管，用于檢測TH2細胞。具體方法：采血1 mL，肝素鋰抗凝，分A試管（標記測定）加入5 μL PMA、10 μL離子霉素和2 μL莫能霉素，B試管（陰性對照）加2 μL莫能霉素。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。分別加入10 μL CD3PC5、CD8ECD，室溫避光孵育15 min，固定，破膜。細胞內(nèi)抗IL-4及IFN-γ單抗標記，流式細胞術檢測，以IFN-γ FITC和IL-4 PE建立雙參數(shù)直方圖，對所確定的CD3+淋巴細胞進行分析，得出Th1（CD3+/IFN-γ（+）和Th2（CD3+/IL-4+）的百分率。

2.4 肺組織標本的采集

小鼠處死后，剝離肺臟，浸泡在10%甲醛溶液中固定24 h，HE染色，置光鏡下檢查。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 病理學觀察

正常組小鼠氣管、肺泡及間隔形態(tài)結構正常，未見充血，未見細胞增生；哮喘模型組小鼠小血管和細支氣管管壁增厚，細胞浸潤，組織水腫；麥芪益肺合劑組小鼠小血管和細支氣管管壁輕度增厚，少量細胞浸潤。病理學切片見圖1。

圖1 病理學切片A.哮喘模型組；B.麥芪益肺合劑組；C.正常組Fig 1 Pathological sectionA.asthma model group；B.Maiqi yifei mixture group；C.normal group

3.2 各組IFN-γ及IL-4細胞因子的變化

與正常組比較，哮喘模型組CD4 IL-4顯著增高（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組CD4 IL-4顯著降低（P＜0.01）。與正常組比較，哮喘模型組CD4 IFN-γ無顯著變化（P＞0.05）；與哮喘模型組比較，麥芪益肺合劑組CD4 IFN-γ顯著升高（P＜0.01）。各組IFN-γ及IL-4細胞因子的變化見表1。

表1 各組IFN-γ及IL-4細胞因子的變化Tab 1 Change of IFN-γ and IL-4 in each group

4 討論

近年的流行病學調(diào)查研究顯示，兒童哮喘的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，1990年全國0～14歲兒童哮喘發(fā)病率為0.19%，2000年上升至1.50%，10年前后患病率上升了64.84%[2]。2006年的資料顯示，上海6～14歲學齡期兒童哮喘的患病率已經(jīng)達到5.92%，比6年前又增加了1.77倍?，F(xiàn)代醫(yī)學研究已證實，氣道變應性炎癥是引起哮喘病的基本病理改變和主要發(fā)病機制，涉及機體免疫功能和神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，消除氣道的慢性炎癥及降低機體的致敏狀態(tài)應貫穿整個治療過程中。近年來制定的全球哮喘防治創(chuàng)議（GINA）中和各國制定的哮喘病防治方案中，均規(guī)定了抗氣道炎癥是哮喘病的主要治療原則。但目前以吸入糖皮質(zhì)激素為主的局部抗炎治療并不能改善哮喘患兒的特應性素質(zhì)，因此我國中醫(yī)中藥針對哮喘緩解期的“扶正固本”治療理念備受關注，可用中西醫(yī)的優(yōu)勢互補提高哮喘病療效和改善哮喘病患兒的預后。

本院自制麥芪益肺合劑是在傳統(tǒng)“玉屏風散”、“生脈飲”“四君子湯”方基礎上綜合而成，由黃芪、麥冬、黨參、防風、五味子、烏梅、陳皮、甘草等10味藥組成。黃芪、黨參大補肺脾元氣，固表實衛(wèi)；麥冬養(yǎng)陰生津，氣陰二補；肺雖主氣，其氣卻來源于后天水谷之氣，欲補肺氣，當先補脾，故配白術、甘草、五味子以抗組胺、抗白三烯D4、抑制肥大細胞脫顆粒；黃芪可促進IL-2的產(chǎn)生，上調(diào)Th1細胞因子；烏梅有抗蛋白過敏作用；防風多糖Xc-2有增強機體免疫功能；麥冬皂苷及麥冬多糖可增加小鼠胸腺、脾臟質(zhì)量，激活小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能；黃芪、茯苓、甘草可誘生IFN-γ[1]。

多項研究顯示，哮喘患者Th1/Th2比值較正常人低，而Th2類細胞因子的表達優(yōu)勢是導致慢性氣道炎癥和氣道高反應的根本原因，因此糾正Th1/Th2比值失衡有利于哮喘的治療。Mossman TR[2]根據(jù)Th細胞分泌細胞因子的不同將其分為2個功能亞群，即Th1、Th2。Th1細胞有合成分泌IFN-γ及IL-2的功能，它可作用于遲發(fā)型超敏反應和抑制過度的Th2反應，從而降低E型免疫球蛋白應答。Th2細胞有合成分泌IL-4的功能，而IL-4在促進B淋巴細胞合成IgE、促發(fā)過敏反應中起了很大作用。IL-4測定結果表明，哮喘模型組高于治療組及正常組，表明其對Th1/Th2細胞的平衡具有積極的調(diào)節(jié)作用，可對細胞內(nèi)IFN-γ表達有促進作用，有利于哮喘癥狀的改善和長期穩(wěn)定。從小鼠肺部病理改變觀察，麥芪益肺合劑對呼吸道非特異性炎癥是有療效的，通過干預，可減輕氣道高反應。

目前中藥制劑的應用困境之一為有效成分的定量定性。本院已成功測定該合劑主要成分之一黃芪甲苷的含量，也完成了防風、甘草、陳皮的定性反應，發(fā)現(xiàn)不同批號麥芪益肺合劑的黃芪甲苷含量存在一定差異，提示原材料的采購選擇應固定產(chǎn)地。

[1]Mccusker C，Chicoine M，Hamind Q，et al.Site-specific sensitization in a murine model of allergic rhinitis：role of the upper airway in lower airways disease[J].J Allergy Clin Immunol，2002，110：891.

[2]Mossman TR，Coffman RL.Heterogeneity of cytokine secretion patterns and fuctions of helper T cells[J].Adv Immunol，1989，46：111.

Effect of Maiqi Yifei Mixture on the Balance of Th1/Th2 in Mice withAsthma and Its Safety Study

CHEN Pei-li（Dept.of Respiratory Medicine，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

WANG Shen-dong，BI Ming-yang，HU Si（Dept.of Pharmacy，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

LIU Jia-ying（Dept.of Clinical Laboratory，Shanghai Children’s Hospital，Shanghai 200040，China）

OBJECTIVE：To investigate the influence of Maiqi yifei mixture on the balance of Th1/Th2 and its safety by observing the changes of T lymphocytes in peripheral blood of mice with respiratory allergy.METHODS：The asthma mice model was induced by 1%OVA，and model mice were randomized into normal groups，asthma model group and Maiqi yifei mixture group.The expressions of IL-4 and IFN-γ in peripheral blood cells were determined by flow cytometer.Mice were given maximal dose of drugs via i.g.gtt.Control group

same quantity of normal saline.The change of symptoms and body weight of mice were observed.RESULTS：Model group showed significant non-specific inflammation reaction symptoms，while Maiqi yifei mixture group hadn’t significant inflammation reaction symptoms.The expression of Th1 in mice of Maiqi yifei mixture group was higher than in asthma model group（P＜0.01）.The IL-4 level in mice of model group was higher than in normal group（P＜0.01）.After giving maximal dosage，the symptom and body weight of mice had no significant difference（P＞0.05）.CONCLUSION：Maiqi yifei mixture can prevent respiratory allergy of mice in the stimulated period.One of its mechanisms is regulating the balance of Th1/Th2.

Maiqi yifei mixture；Th1/Th2；Mice；Asthma；Safety

R285；R97

A

1001-0408（2010）39-3669-03

2010-07-17

2010-07-26）