孫海文,劉 磊,李鳴皋,蔣春雷△

(1.海軍總醫(yī)院航空潛水醫(yī)學(xué)中心,北京 100048;2.第二軍醫(yī)大學(xué)航海醫(yī)學(xué)教研室應(yīng)激研究實驗室,上海 200433)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GCs)在哮喘治療中,除了調(diào)節(jié)免疫和炎癥細胞的功能,對于氣道平滑肌細胞的收縮強度也存在著直接的調(diào)節(jié)作用,臨床上哮喘急性發(fā)作時,單純給予GCs吸入治療(不含茶堿類藥物),在數(shù)分鐘內(nèi)就能迅速緩解氣道梗阻的癥狀,氣道的直徑及通氣能力快速恢復(fù)[1]。本實驗檢測了地塞米松(dexemisone,Dex)對大鼠平滑肌細胞內(nèi)由乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)激動的游離鈣[Ca2+]i水平變化及抑制型 PLC(ser1105-phospho-PLCβ)含量的快速影響。并設(shè)立米非司酮(Roussel-Uclaf 38486 RU486)和放線菌酮(cycloheximide,CHX)對照,擬證明糖皮質(zhì)激素可快速抑制激動劑引起的氣道平滑肌細胞收縮,并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用豚鼠SD大鼠(180～220)g購于第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心,皆為雄性,飼養(yǎng)于22～26℃的環(huán)境,控制濕度55%,12 h照明與黑暗交替,動物皆自由攝食,實驗前動物無干擾飼養(yǎng)一周。

1.2 實驗分組

(1)空白對照組:細胞不進行處理直接制備樣本;(2)陽性對照組:ACh10-4mol/L終濃度反應(yīng) 2 min,不給Dex;(3)Dex處理組:提前10 min加10-6、10-7、10-8mol/L GC;(4)RU486阻斷組:給 Dex前 50 min加10-5mol/L RU486并溫浴;(5)RU486對照組:加RU486處理,不給Dex;(6)CHX阻斷組:給Dex前50 min加10-5mol/L CHX并溫浴;(7)CHX對照組:加CHX處理,不給Dex。其中選取10-7mol/L GC為阻斷組Dex濃度。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠氣道平滑肌細胞原代培養(yǎng) 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,分離組織,獲得氣管。沿氣管腹面剪開管壁,用消毒過的棉簽輕撫氣管內(nèi)面,除去內(nèi)皮層。沿軟骨環(huán)邊緣垂直切下氣管平滑肌條,洗滌后切成1 mm的碎片,加入含膠原酶Ⅰ(1 mg/ml)和DNA酶(20 U/ml)及20%FBS的DMEM培養(yǎng)液,37℃消化 7h 1 000 r/min離心5min,沉淀重懸于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,吸管小心吹打20次,靜置自由沉淀3 min,取中上部細胞懸液,進行細胞計數(shù),調(diào)整細胞濃度(104cells/ml)后接種于培養(yǎng)皿,培養(yǎng)細胞經(jīng)α-actin免疫組化鑒定為平滑肌細胞。常規(guī)環(huán)境培養(yǎng),24 h后首次換液,培養(yǎng)液血清濃度降低至15%,此后每48 h換液一次,直至實驗開始。

1.3.2 Fura-2/AM顯微熒光檢測技術(shù)檢測胞漿游離鈣離子[Ca2+]i濃度 采用Hallett等[2]的方法。Fura-2/AM負載:超凈臺內(nèi),將原代培養(yǎng)平滑肌細胞的玻片移入自制小培養(yǎng)皿。1 mmol/L Fura-2/AM 4 μ l,0.01 mol/L F-127 20 μ l加入 2 ml培養(yǎng)液搖勻 ,每皿200 μ l,37°C 搖動負載60 min。負載結(jié)束后,移除負載液,HEPES緩沖液洗兩次后加入180 μ l(或160 μ l)HEPES緩沖液置于顯微鏡載物臺上,按照實驗分組,Dex預(yù)處理10 min后加入Ach。用filter wheel使激發(fā)波長在340 nm和380 nm之間快速切換,發(fā)射波長為 510 nm,曝光時間 300 ms。實驗中應(yīng)用MetaFluo軟件進行圖像分析,記錄340 nm和380 nm處熒光強度(F340 nm、F380 nm)及F340 nm/F380 nm比值(簡稱ratio值)。

1.3.3 Western blot 凝膠由質(zhì)量濃度5%的濃縮膠和7.5%的分離膠組成,凝膠總長10.5 cm,其中濃縮膠1.5 cm,分離膠9 cm。實驗步驟如下:去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2～3遍。加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10～20 min;刮下細胞,收集在EP管后超聲(100～200 w)3 s,2次;4℃、12 000×g離心2 min。取少量上清進行定量;將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度,按80 μ g蛋白計算出所需樣品體積上樣,60 V恒壓電泳約30 min。待染料前沿進入分離膠后,電壓改為150 V,待染料達分離膠底部停止。marker所在凝膠部分行考馬斯亮藍染色,樣品所在凝膠部分蛋白質(zhì)180 mA恒流電轉(zhuǎn)印100min濕式轉(zhuǎn)印。麗春紅染液染膜20 min,硝酸纖維素膜置于含5%脫脂奶粉的TBS中,37℃振搖1 h封閉。單抗(1∶500)4℃孵育過夜,次日再搖蕩孵育1 h。81‰TBS-T洗15 min×3次。HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育 2 h。101‰TBS-T洗15 min×3次。ECL發(fā)光試劑盒顯影、拍照。

1.4 圖像分析

Western blot結(jié)果掃描輸入電腦后用上海復(fù)日圖像分析系統(tǒng)分別測定各組目的蛋白和β-actin的積分灰度值,數(shù)據(jù)處理時用各組積分灰度值除以相應(yīng)的β-actin灰度值獲得相對積分灰度值。設(shè)陰性對照組灰度值是100%,背景色為0%。各組Western blot相對灰度值數(shù)據(jù)與陰性對照組相比求得灰度比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Dex對細胞內(nèi)游離鈣[Ca2+]i濃度上升有快速抑制作用

實驗顯示,ACh能夠使大鼠氣道平滑肌細胞內(nèi)[Ca2+]i立即升高,并很快達到峰值,到達峰值后很快開始回落,至90 s左右重新回到基態(tài)水平。給予不同濃度地賽米松預(yù)處理10 min后再給與乙酰膽堿刺激,其峰值與對照組比較顯著降低(10-6mol/L,P＜0.01;10-7mol/L,P＜0.05),10-8mol/L時,雖有下降趨勢,但統(tǒng)計未見顯著差異(表1)。

Tab.1 Dex(dexemisone)inhibit peak of[Ca2+]i in airway smooth muscle cells(Ratio340/380,±s,n=10)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Peak[Ca2+]i Resting values[Ca2+]i Control 0.89±0.06 0.56±0.03 ACh+Dex(10-8) 0.85±0.05 0.55±0.04 ACh+Dex(10-7) 0.77±0.06* 0.56±0.05 ACh+Dex(10-6) 0.69±0.04** 0.54±0.04

2.2 RU486和CHX對Dex抑制游離鈣上升作用沒有顯著影響

濃度10-6mol/L的選擇性糖皮質(zhì)激素核受體拮抗劑RU486溫浴細胞60 min,對于10-7mol/L的Dex抑制[Ca2+]i升高的作用沒有明顯影響(表2),10-5mol/L蛋白合成的阻斷劑CHX處理細胞,溫浴60 min,對于Dex抑制細胞內(nèi)[Ca2+]i升高的作用同樣沒有明顯的影響(表3),兩者本身對胞內(nèi)游離鈣濃度亦無顯著影響。

Tab.2 RU486(Roussel-Uclaf 38486)with the inhibitory effect of Dex(dexemisone)(Ratio340/380, ±s,n=10)

Tab.2 RU486(Roussel-Uclaf 38486)with the inhibitory effect of Dex(dexemisone)(Ratio340/380, ±s,n=10)

*P＜0.05 vs control group

Group Peak[Ca2+]i Resting values[Ca2+]i Control 0.87±0.05 0.55±0.04 ACh+RU486 0.86±0.05 0.55±0.03 ACh+Dex 0.76±0.06* 0.53±0.05 ACh+Dex+RU486 0.77±0.04* 0.56±0.04

Tab.3 CHX(cycloheximide)with the inhibitory effect of Dex(dexemisone)(Ratio340/380,±s,n=10)

Tab.3 CHX(cycloheximide)with the inhibitory effect of Dex(dexemisone)(Ratio340/380,±s,n=10)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Peak[Ca2+]i Resting values[Ca2+]i Control 0.86±0.03 0.56±0.04 ACh+CHX 0.88±0.05 0.55±0.03 ACh+Dex 0.72±0.03** 0.54±0.03 ACh+Dex+CHX 0.75±0.04* 0.52±0.05

2.3 Dex對細胞內(nèi)抑制型PLC含量有快速上調(diào)作用

Western blot結(jié)果顯示,細胞內(nèi)抑制型PLC分子(phospho-PLCβser1105)含量在各濃度Dex處理組相對灰度值均高于陽性對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(10-6mol/L 、10-7mol/L,P＜0.01;10-8mol/L,P＜0.05),并且隨GCs濃度上升灰度有升高趨勢(圖1)。

2.4 RU486和CHX對Dex上調(diào)抑制型PLC含量作用無顯著影響

Western blot實驗中同時設(shè)立了Dex 10-7mol/L條件下RU486和CHX對照組,平滑肌細胞經(jīng)10-6mol/L RU486及10-5mol/L CHX溫浴60 min不能顯著影響Dex對于細胞內(nèi)抑制型PLC分子(phospho-PLCβser1105)含量的上調(diào)作用(P＞0.05,圖1)

3 討論

氣道平滑肌是氣道壁的重要組成部分,是氣道各組成成分中伸縮性最強的組織類型,對于氣道直徑的調(diào)節(jié)起著重要的作用。哮喘急性發(fā)作時,氣道管徑急劇減小甚至某些小氣道的閉塞,是造成呼吸困難最主要的原因之一。傳統(tǒng)的觀念認為,糖皮質(zhì)激素(GCs)在哮喘治療中的作用是通過基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成最終實現(xiàn),通常需要數(shù)小時甚至數(shù)天的時間[3]。而Ketchell早期報道過吸入氟替卡松(fluticasone)能夠快速緩解氣道的局部過敏反應(yīng)[4],周建等也在實驗中發(fā)現(xiàn),吸入GCs能夠在10 min內(nèi)有效地減輕免疫反應(yīng)引起的豚鼠氣道梗阻,維持呼吸的潮氣量和肺順應(yīng)性。進一步細胞水平實驗顯示,豚鼠氣道平滑肌細胞的收縮能被布地奈德快速抑制[5]。這些作用可能是通過糖皮質(zhì)激素的非基因組效應(yīng)實現(xiàn)的,但其中的機理并不清楚。

Fig.1 Dex elevated the intracellular levels of phospho-PLCβ(ser1105).Neither the RU486(Roussel-Uclaf 38486)nor CHX(cycloheximide)could alter the effects(n=5)A:Immunoblot for Phosphor-PLCβ(ser1105)of ASMCs in different treatment of Dex;B:Relative values of immunoblot for Phosphor-PLCβ(ser1105)in ASMCs with different treatment of Dex

本研究顯示,預(yù)先用Dex溫浴大鼠平滑肌細胞10 min后,再用ACh激動細胞,細胞內(nèi)游離鈣峰值[Ca2+]i與對照組比較顯著降低(10-6mol/L,P＜0.01;10-7mol/L,P＜0.05),尤其在Dex濃度高時更加明顯。同時,對照實驗顯示競爭性皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU486不能阻斷這一效應(yīng),這表明該反應(yīng)不通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合即可實現(xiàn);而蛋白合成阻斷劑CHX亦不能阻斷該效應(yīng)則證明這一過程中無新蛋白的合成。

氣道平滑肌的收縮狀態(tài)和平滑肌細胞內(nèi)的游離鈣離子濃度關(guān)系密切,其收縮主要由兩條途徑所介導(dǎo),即肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑,其中又以前一條途徑比較重要[6]。

PLC作為MLCK通路和PKC通路共同的樞紐性蛋白,與G蛋白直接作用的信號分子,其中PLCβ催化活性最為強大且在平滑肌細胞內(nèi)含量最高的亞型[7]。PLCβ第1105位的絲氨酸(ser)是PLC重要的抑制性磷酸化位點,該位點磷酸化時酶催化區(qū)域的構(gòu)形發(fā)生變化,與催化對象的親和力顯著減弱,其酶活性隨之下降,PLC處于活性抑制狀態(tài),對PIP2分解的催化效應(yīng)明顯降低[8]。在PLC的這一變化中,其蛋白的編碼順序和蛋白成分并沒有發(fā)生變化,只是在1105位上的絲氨酸發(fā)生了磷酸化狀態(tài)的變化,磷酸化反應(yīng)的發(fā)生只需要很短的時間,這也和本實驗發(fā)生速度快,不經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄和蛋白重編碼的假設(shè)是相符和的。

本研究顯示,Dex處理大鼠平滑肌細胞10 min能夠使細胞內(nèi)PLCβ-1105ser磷酸化分子含量增加,并且和呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系,可見,糖皮質(zhì)激素能夠通過某種機制使PLC發(fā)生1105位絲氨酸的磷酸化,明顯降低PLCβ催化活性,從而使其下游的一系列反應(yīng)受到抑制。首先,影響MLCK途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),PLC活性降低,其催化產(chǎn)生的下游信號分子IP3減少,肌漿網(wǎng)上IP3受體結(jié)合減少,胞內(nèi)鈣釋放受抑制,平滑肌細胞內(nèi)游離鈣濃度上升幅度減小,使細胞收縮強度下降。其次,影響 PKC途徑,其催化的PIP2能力下降,故分解產(chǎn)物DAG產(chǎn)生減少,對PKC激活率降低,PKC途徑對平滑肌細胞收縮的影響由此減弱,此外,PKC的活化同時依賴于細胞內(nèi)鈣的濃度升高[9],故細胞內(nèi)鈣濃度的下降本身對于PKC的活性就是一個下調(diào)的因素。當然,影響PKC活性的影響因子很多,PLC的活性只是其中一個方面。有報道指出,PKC本身對PLC的活性也有反饋調(diào)節(jié)作用,活化的PKC能夠使PLC分子1105位的ser發(fā)生磷酸化,抑制PLC的活性[10],從而抑制胞內(nèi)游離鈣升高,減輕平滑肌細胞收縮強度。

實驗中,我們還設(shè)立了Dex 10-7mol/L條件下GCs核受體阻斷劑RU486對照組和蛋白合成阻斷劑CHX對照組,提前給予10-6mol/L RU486及10-5mol/L CHX溫浴60 min,對于Ach激動的胞內(nèi)游離鈣升高及Dex上調(diào)平滑肌細胞內(nèi)PLCβ-ser1105磷酸化分子含量的作用均沒有顯著影響。這進一步證實了在本實驗中Dex引起的PLCβ活性變化為非基因組效應(yīng)介導(dǎo),不需與核受體發(fā)生特異性的結(jié)合,反應(yīng)中沒有蛋白合成。

本實驗驗證了糖皮質(zhì)激素可以快速抑制[Ca2+]i濃度升高,并且上調(diào)細胞內(nèi)抑制型PLC的含量,從而抑制乙酰膽堿引起的下游反應(yīng),減輕平滑肌細胞收縮強度;該作用可在短時間內(nèi)發(fā)生,不需要通過糖皮質(zhì)激素的經(jīng)典途徑,可能是通過非基因組機制實現(xiàn)的,但具體機制尚不明。這種快速非基因組抑制作用,為糖皮質(zhì)激素在哮喘急性發(fā)作時的吸入治療的作用機理提供了新的理論依據(jù),為臨床新藥開發(fā)思路提供了新的研究方向。

[1]Charmandari E,Kino T,Chrousos G P.Glucocorticoids and their actions:an introduction[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1024:1-8.

[2]Hallett M B,Davies EV,Pettit E J.Fluorescent methods for measuring and imaging cytosolic free Ca2+in neutrophils[J].Methods,1996,9(3):591-606.

[3]Emala,C W,Clancy J,Hirshman C A.Glucocorticoid treatment decreases muscarinic receptor expression in canine airway smooth muscle[J].AmJ Physiol,1997,272(4 pt 1):L745-751.

[4]Ketchell R I,JensenM W,Lumley P,et al.Rapid effect of inhaled fluticasone propionate on airway responsiveness to adenosine 5′-monophosphate in mild asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2002,110(4):603-606.

[5]SunH W,Miao C Y,Liu L,et al.Rapid inhibitory effect of glucocorticoids on airwaysmooth muscle contractions in guinea pigs[J].Steroids,2006,71(2):154-159.

[6]Allen B G,Walsh M P.The biochemical basis of the regulation of smooth muscle contraction[J].Trends Biochem Sci,1994,19(9):362-368.

[7]Yue C,Dodge K L,Weber G,et al.Phosphorylation of serine 1105 by protein kinase A inhibits phospholipase Cβ3stimulation by Galphaq[J].J Biol Chem,1998,273(29):18023-18027.

[8]Yue C,Ku C Y,Liu M,et al.Molecular mechanism of the inhibition of phospholipase C β3 by protein kinase C[J].J Biol Chem,2000,275(39):30220-30225.

[9]Buchner K.Protein kinase C in the transduction of signals toward and within the cell nucleus[J].Eur J Biochem,1995,228(2):211-221.

[10]Richardson R M,Ali H,Tomhave,E D,et al.Cross-desensitization of chemoattractant receptors occurs at multiple levels.Evidence for a role for inhibition of phospholipase C activity[J].J Biol Chem,1995,270(46):27829-27833.