趙 彤,黃 欣,朱玲玲,熊 雷,張 寬,吳麗穎,劉 兵,吳奎武△,范 明△

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所腦保護(hù)與可塑性研究室,北京 100850;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院307醫(yī)院,北京 100850)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)是1992年Reynolds等從成年鼠紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖,具有多種分化潛能的細(xì)胞群,并提出了NSCs的概念,即一類具有自我復(fù)制更新能力、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞[1]。目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植和基因治療載體的研究。神經(jīng)干細(xì)胞的移植為腦組織損傷的修復(fù)治療提供了有效的手段。

成年動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生主要存在兩個(gè)區(qū)域:一個(gè)位于側(cè)腦室的腦室下區(qū)(SVZ),該區(qū)域能產(chǎn)生新的內(nèi)源性干細(xì)胞,并沿喙側(cè)遷移流遷移至嗅球;另一區(qū)域?yàn)楹ｑR齒狀回(DG)的顆粒下層(SGZ),SGZ的干細(xì)胞可發(fā)育形成新的顆粒細(xì)胞[2-3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)間歇性低氧處理可促進(jìn)這種內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖;腦缺血也可以顯著促進(jìn)成體SVZ和DG的神經(jīng)再生[4];另一方面,在體腦組織處于一種相對(duì)低氧的環(huán)境中,平均氧含量為1%～5%,甚至更低。這種低氧或低糖的微環(huán)境是如何影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖和代謝的,目前尚不知曉。因此,本研究利用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞觀察低糖、低氧對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD孕大鼠(E13.5 d)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12(高糖12100-038、低糖 31600-026、F1221700-026,G ibco 公司)、N2、B27(G ibco公司);表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,Promega公司);細(xì)胞葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度測(cè)定(301醫(yī)院生化科)。

1.2 NSCs分離培養(yǎng)和鑒定

戊巴比妥鈉(1 mg/100g bw)腹腔注射麻醉SD大鼠,取出胚胎,解剖鏡下分離中腦,去除腦膜和血管,0.125%胰酶37℃消化30min,終止消化后,將組織吹打懸浮成單細(xì)胞,加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖/低糖 DMEM/F12+20ng/L EGF、bFGF+1%N2、B27、谷氨酰胺和雙抗),以1×106cells/ml密度接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),3-5 d后傳代。傳至第三代進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 不同葡萄糖濃度和低氧條件及分組

實(shí)驗(yàn)采用不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)以及不同的氧濃度處理:高糖(4.5 g/L,HG)、低糖(1.4 g/L,LG);常氧 (20%O2)、低氧 (3%O2,Thermo 3111,Billups-Rothenberg,Del Mar,CA)NSCs在不同糖濃度下培養(yǎng)至第三代進(jìn)行低氧處理,分為四組:低糖常氧(Low glucose+Normoxia,L+N)、低糖低氧(Low glucose+Hypoxia,L+H)、高糖常氧(High glucose+Normoxia,H+N)、高糖低氧(High glucose+Hypoxia,H+H);培養(yǎng) 1 d、3 d、5 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖

細(xì)胞以 3×104cells/well接種于 96孔板(Costar),每組接種20孔,置于常氧或低氧條件下培養(yǎng)1 d,3 d,5 d,每孔加入10μl cell counting(細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8,日本dojindo),4h后采用酶聯(lián)儀檢測(cè),波長(zhǎng)450nm的吸光度值。

1.5 生化分析儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度

細(xì)胞以5×105cells/well接種于35 mm培養(yǎng)皿(Costar),每組接種3皿。處理結(jié)束后收集細(xì)胞,600r/min離心4 min,利用全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI-7600,日本)測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖、丙酮酸和乳酸濃度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)代謝相關(guān)酶的表達(dá)

細(xì)胞以 5×104cells/well接種于培養(yǎng)瓶中(Costar),分別置常氧和低氧條件下培養(yǎng)3 d,提取總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè),總RNA提取及RTPCR操作過程按試劑盒說明進(jìn)行。以18S RNA為內(nèi)參,PCR條件為94℃30s,60℃1 min,68℃2 min,30個(gè)循環(huán),68℃7 min。引物序列為:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter,G LUT4:Sense:5’GGCTGTG AGTG AGTGCTTT3’;Anti-sense:5’ GGTTTCTGCTCCCTATCGT 3’;54℃424 bp)。葡萄糖激酶 (glucokinase,GK:Sense:5’ GTG AGGTCGGCATG ATTG 3’,Antisense:5’CCACTTGTG ACACG AAACG 3’,56℃ 357 bp);丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK:Sense:5’G ATGTGG ATCG AAGGGTC 3’,Anti-sense:5’GGTTG AAAG AAATAGGGTGTA 3’,53℃191 bp);乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH:Sense:5’ACAAGG AGCAGTGG AAGG 3’,Anti-sense:5’GG ACGCTG AGG AAG ACAT 3’,58℃206 bp)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低糖低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

低糖和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的NSCs在常氧(20%O2)和低氧(3%O2)條件下分別培養(yǎng)1 d,3 d,5 d后,用CCK-8檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明:低糖或高糖組培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在低氧后3 d和5 d細(xì)胞的增殖都比常氧組有明顯增加(低糖低氧vs低糖常氧:3 d 1.31±0.0537vs0.5745±0.0488;5 d 3.1401±0.171vs1.7525±0.102;高糖低氧 vs高糖常氧:3 d 1.17±0.0823vs0.416±0.0226;5 d 3.1086±0.1799vs 1.1907±0.0582;P<0.05);而在常氧條件下,低糖組較高糖組的NSCs的增殖在第5天時(shí)更為明顯(低糖常氧:1.7525±0.102高糖常氧:1.1907±0.0582;P<0.05)。表明低糖或低氧均能促進(jìn)NSCs的增殖,低氧低糖或低氧高糖的作用尤為明顯(圖1見下頁)。

2.2 低糖低氧對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度的影響

Fig.1 E ffect of low oxygen and/or low glucose on the proliferation of neural stem cellsin vitro L+N:Low glucose+normoxia;L+H:Low glucose+hypoxia;H+N:High glucose+normoxia;H+H:High glucose+hypoxia

低氧和低糖均能在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的體外增殖,那么該條件下細(xì)胞的代謝又發(fā)生怎樣的變化呢?我們將低糖和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的NSCs在常氧(20%O2)和低氧(3%O2)條件下分別培養(yǎng)1 d,3 d,5 d后,進(jìn)一步利用生化分析儀分別測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖、丙酮酸、乳酸的濃度。結(jié)果如圖所示:(1)低糖低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖濃度的影響:隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖濃度有不同程度的下降,高糖常氧組變化很小,只在低氧5 d后才有所下降(高糖常氧:1 d 18.4967±0.2538,3 d 18.4467±0.6269,5 d 17.64±0.4349;P<0.05);而低糖組在合并低氧后,葡萄糖濃度下降速率最為顯著(低糖低氧:1 d 9.1875±0.1682,3 d 4.02±0.1757,5 d 0.01±0.01;P<0.05,圖 2)。(2)低糖低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中丙酮酸濃度的影響:細(xì)胞培養(yǎng)1 d時(shí),低糖處理組的丙酮酸含量都明顯高于高糖處理組(低糖低氧 vs高糖低氧:7.3425±0.0885vs3.2367±0.125;P<0.05),培養(yǎng)至5 d時(shí),低糖處理組丙酮酸濃度迅速下降(低糖常氧 vs高糖常氧:5 d 1.145±0.1812vs0.21±0.0751;P<0.05),以低糖低氧組最為明顯(低糖低氧 vs高糖低氧:3 d 3.56±0.0589vs2.3833±0.125;5 d 0.21±0.21vs0.65 ±0.0872;P<0.05,圖 3)。(3)低糖低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量的影響:低糖低氧處理1 d后,低糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸的含量均高于高糖組,3 d時(shí),各組乳酸含量均有增加,而低糖低氧組增加的幅度最大;培養(yǎng)至5 d時(shí),高糖低氧組含量也有了明顯的升高。但高糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸含量明顯低于低糖組 (表1見下頁)。因此,細(xì)胞在低糖低氧環(huán)境下培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞的代謝發(fā)生明顯的變化,特別是糖酵解明顯加強(qiáng),丙酮酸和乳酸的產(chǎn)生明顯增加,并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)葡萄糖和丙酮酸的利用增加而導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖和丙酮酸的濃度逐漸減少。

Fig.2 G lucose conctration in the media of neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

Fig.3 Pyruvic acid concentration in the media of neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

2.3 低糖低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞中代謝相關(guān)酶表達(dá)的影響

既往的研究表明在低氧促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中,低氧誘導(dǎo)因子HIF1是關(guān)鍵的調(diào)控因子,我們進(jìn)一步檢測(cè)了與代謝相關(guān)的HIF1的靶基因表達(dá)的變化。神經(jīng)干細(xì)胞在不同的條件下培養(yǎng)3 d后,用RT-PCR的方法檢測(cè)代謝相關(guān)的酶,如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(G LUT4)、葡萄糖激酶 (GK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)的表達(dá)(圖4見下頁)。結(jié)果顯示:在低糖或低氧時(shí),G lut4和PK的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。以上結(jié)果表明,低氧能促進(jìn)NSCs的增殖,而以低氧和低糖共同作用時(shí)更為明顯;在低氧低糖條件下,細(xì)胞的代謝發(fā)生變化,葡萄糖的利用明顯增加,主要通過糖酵解途徑代謝產(chǎn)能。

3 討論

本研究探討了低氧和低糖對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和代謝的影響。主要作用如下:(1)低氧或低糖都可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖;(2)低氧和低糖或高糖共同作用一定的時(shí)間,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的體外增殖更為明顯;(3)在低氧和低糖條件下,神經(jīng)干細(xì)胞的代謝發(fā)生明顯變化,葡萄糖的利用增加,丙酮酸和乳酸的產(chǎn)生增加,主要通過糖酵解代謝途徑。

Tab.1 Effect of low oxygen and/or low glucose on the lactic acid content(,n=3)

Tab.1 Effect of low oxygen and/or low glucose on the lactic acid content(,n=3)

＊P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vslow glucose; △P<0.05vs1 d; ▲P<0.05vs3 d

Time L+N H+N L+H H+H 1 d 0.565±0.010 <0.5 0.798±0.017＊ <0.5#3 d 2.943±0.065△ 1.227±0.012#△ >12＊ 3.26±0.065＊#△5 d 9.740±1.075△▲ 3.650±0.006#△▲ >12＊ >12＊△▲

Fig.4 Representative photography of G lut4,PK,GK and LDH expression in neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

目前對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)都是在常氧(20%O2)和高糖等充分的營(yíng)養(yǎng)的條件下進(jìn)行的[5],但這和細(xì)胞在體的環(huán)境完全不同,如在成年哺乳動(dòng)物大腦,組織間隙的氧含量約1%～5%,其他區(qū)域組織的含氧水平甚至更低[6];特別是腦缺血后引起的組織缺糖缺氧也是利用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療損傷所面臨的微環(huán)境。因此,在該研究中,神經(jīng)干細(xì)胞在單純低糖條件下,在培養(yǎng)的第3,5天時(shí)細(xì)胞的增殖較高糖組明顯;加上低氧(3%O2)環(huán)境后,在低糖或高糖和低氧的環(huán)境中,神經(jīng)干細(xì)胞的增殖更加明顯。同樣地,細(xì)胞在低糖或低氧環(huán)境中,代謝都發(fā)生了明顯的變化,細(xì)胞在低氧的環(huán)境中主要利用葡萄糖進(jìn)行糖酵解途徑代謝產(chǎn)能,如圖3所示,在低糖低氧環(huán)境中培養(yǎng)液中的葡萄糖含量明顯降低,到培養(yǎng)第5天時(shí)幾乎降為零;而在高糖環(huán)境中,培養(yǎng)液中的葡萄糖含量從培養(yǎng)第5天才開始下降;與此相對(duì)應(yīng),培養(yǎng)液中丙酮酸含量低氧組較常氧組都明顯增加,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少;乳酸的含量則逐漸增加。對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,雖然低糖和低氧都能在一定的程度上促進(jìn)其增殖,但由于細(xì)胞主要依賴葡萄糖酵解產(chǎn)能,因此,在高糖環(huán)境中更能提供足夠的葡萄糖而維持細(xì)胞持續(xù)的增殖。

低氧誘導(dǎo)因子HIF-1是細(xì)胞在低氧時(shí)關(guān)鍵的調(diào)控因子之一,目前發(fā)現(xiàn)受其調(diào)控的靶基因有60多個(gè),這些基因產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、能量代謝、血管重塑等方面發(fā)揮了重要作用[7]。我們既往的研究顯示,低氧誘導(dǎo)因子HIF1是低氧促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在低氧促神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中低氧誘導(dǎo)因子(HIF1)的表達(dá)增加[8];這里我們用RT-PCR的方法檢測(cè)了其下游的影響細(xì)胞代謝的相關(guān)基因的表達(dá),如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(G luT4)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)。結(jié)果表明:在低糖或低氧時(shí)G lut4和PK的表達(dá)也明顯高于對(duì)照組。以上結(jié)果表明,低氧和低糖通過增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),以及糖酵解途徑中丙酮酸激酶的表達(dá),來調(diào)節(jié)低氧低糖的環(huán)境中神經(jīng)干細(xì)胞的代謝發(fā)生變化。因而,認(rèn)識(shí)低氧和低糖作為一種有效的刺激信號(hào)在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和代謝中的作用,對(duì)于臨床某些疾病的治療提供了新思路。

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