牛燕媚,苑 紅,張 寧,傅 力,2,△

(1.天津體育學(xué)院健康與運動科學(xué)系、天津市運動生理與運動醫(yī)學(xué)重點實驗室,天津 300381;2.天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)與運動醫(yī)學(xué)系,天津 300070;3.天津市基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300070)

雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR)屬于磷脂酰肌醇相關(guān)蛋白激酶(phosphatidylinositol kinase-related protein,PIKK)家族,是磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinases,PI3-kinase/protein kinase B,PI3K/PK B)信號通路下游的一個效應(yīng)蛋白,具有絲/蘇氨酸激酶活性。研究認為mTOR具有感受細胞外營養(yǎng)成分含量、能源物質(zhì)水平變化以及生長因子等信號的能力并通過激活其下游效應(yīng)蛋白對細胞的生長、分化、生存以及蛋白合成等機體代謝過程進行調(diào)節(jié)。當(dāng)細胞外營養(yǎng)物質(zhì)過剩時可通過激活mTOR信號傳導(dǎo)通路,活化后的核糖體S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase,S6K1)可通過磷酸化胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)而抑制胰島素的信號傳導(dǎo),使PI3K/PK B信號通路失活,引起胰島素抵抗(insulin resistance,IR)的發(fā)生。以高脂飲食喂養(yǎng)的S6K1-/-小鼠在體研究以及用siRNA技術(shù)去除S6K1基因表達在細胞水平研究都表現(xiàn)出PK B磷酸化增加而保持胰島素敏感。有氧運動可以促進機體能量代謝以提高機體組織對胰島素的敏感性,已經(jīng)廣泛用于臨床預(yù)防和治療代謝綜合征的輔助手段。但到目前為止,對其產(chǎn)生作用的分子生物學(xué)機制還不完全清楚。尤其對有氧運動后mTOR/S6K1信號通路影響的研究多以急性單次運動為主。有報道顯示在一次性抗阻運動后,mTOR和S6K1的活性均呈顯著性增強;而對長期有氧耐力運動后的研究甚少。因此,本研究采用C57BL/6小鼠,通過喂飼高脂飲食8周以建立IR動物模型,并通過觀察不同飲食條件(正常飲食和高脂飲食)下mTOR/S6K1的表達情況。同時對動物施以6周75%VO2max的跑臺訓(xùn)練以觀察在不同飲食條件下mTOR/S6K1的表達情況,分析mTOR/S6K1在IR的發(fā)生中的作用以及有氧運動對IR進程的調(diào)節(jié)作用,以期探究其分子生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

本實驗選用40只8周齡雄性C57BL/6小鼠,體重為(24.6±0.75)g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠在本實驗室隨機分籠飼養(yǎng),自由進食飲水,光照12 h/d。動物室室溫20～25℃,濕度為30%～40%。

將實驗動物進行適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為正常飲食組(20只)和高脂飲食組(20只)。分別喂以正常飼料和高脂飼料8周,經(jīng)空腹血清胰島素(fasting insulin,FINS)值具有顯著變化和口服葡萄糖耐量試驗評價后確定IR模型成功。隨后將正常飲食組隨機分為正常飲食安靜組(10只)和正常飲食運動組(10只),高脂飲食組分為高脂飲食安靜組(10只)和高脂飲食運動組(10只)。

1.2 動物飼料配方

正常飲食組喂以標準飼料;高脂飲食組喂以高脂飼料,其成分蛋白20%KCal、碳水化合物35%KCal、脂肪45%KCal;以上飼料均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

1.3 運動方案

運動組進行跑臺訓(xùn)練,正式運動前對小鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練,以使其適應(yīng)試驗跑臺。后進行每天1次,每次以12 m/min(相當(dāng)于75%VO2max)的速度運動60min,每周5次,訓(xùn)練期為6周。

1.4 IR模型的建立

采用高脂飲食方式建立 IR模型,8周齡雄性C57BL/6小鼠10只經(jīng)14周高脂飲食后檢測空腹血清中胰島素水平、糖耐量及觀察胰島形態(tài)學(xué)變化來鑒定IR模型的成立。與對照組相比,小鼠FINS水平呈顯著性升高,同時糖耐量明顯受損 (灌注葡萄糖后30,60,90和120min血糖值與對照組呈顯著性升高)即可確定該小鼠已發(fā)生IR,若胰島β細胞團面積增大可確定已進入IR失代償期。

1.5 檢測指標

1.5.1 口服糖耐量(OGTT)及空腹血漿胰島素的測定在14周時,將各組小鼠禁食14～16 h,鼠尾靜脈取血。采用One T ouch小型血糖儀測定小鼠空腹(T=0min)血糖值。然后迅速給小鼠按體重 (10μl/g)灌注20%葡萄糖溶液 (Sigma),分別在灌注后T15、T30、T60、T90、T150、T180min 進行鼠尾靜脈取血,檢測各點的血糖值。經(jīng)鼠尾靜脈取血采用ELISA法測空腹血漿胰島素。胰島素ELISA試劑盒購于LINCO公司。

1.5.2 標本采集 14周時將各組小鼠禁食12 h,進行麻醉,隨后分離骨骼肌組織,置于液氮保存以備提取總RNA和蛋白質(zhì)。同時取小鼠胰腺組織以10%福爾馬林固定,以備石蠟切片。

1.5.3 胰島β細胞形態(tài)學(xué)觀察 將甲醛固定的胰腺經(jīng)乙醇梯度脫水,再經(jīng)丙酮、二甲苯脫水透明后,用石蠟包埋,切片,HE法染色。高倍鏡下觀察單一視野下胰島β細胞團面積,統(tǒng)計分析各組間差異。

1.5.4 Northern blot法測定骨骼肌中mTOR和S6K1 mRNA表達 采用 Trizol(Invitrogen)方法提取骨骼肌中總RNA,分光光度計測定總RNA的濃度和純度。配制甲醛變性凝膠,取等量總RNA(10μg)上樣,35 V電壓電泳過夜。采用Turboblotter將RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜,后紫外交聯(lián)固定。探針制備采用TOPOTA克隆法:PCR采用引物序列為 mTOR上游5’-GCGGCCTGG AAATGCGG AAGTGG-3’,下游5’-AAAGCCCCAAGG AGCCCCAACA-3’;S6K1 上游 5’-GGCGGG ACGGCTTTTACCT-3’,下游 5’-ACCTTTCCATAGCCCCCTTTACC-3’。將PCR產(chǎn)物克隆到TOPO載體 (Invitrogen)內(nèi),轉(zhuǎn)化細菌,擴增重組質(zhì)粒DNA,并用EcoRⅠ酶切回收DNA片斷,DNA測序鑒定克隆的DNA片段。使用Stratagene隨機引物標記試劑盒和α-32PdCTP標記探針,45℃雜交過夜。次日,取出雜交膜,洗膜后放入裝有增感屏的暗盒中,曝光48 h。使用Typoon-9400圖像掃描儀分析結(jié)果。

1.5.5 Western blot測定骨骼肌中 mTOR、S6K1和pS6K1-Thr389蛋白表達 采用NP-40(sigma)法提取骨骼肌中總蛋白,在垂直電泳儀上用等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)8%SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)移于PVDF膜上。用5%BSA(Amresco)按1∶1000比例稀釋一抗 (cell signal technology),4℃孵育過夜。次日1×TBST洗滌5 min×3次,用5%脫脂奶粉按1∶7500比例稀釋二抗 (Invitrogen),室溫孵育1 h,1×TBST充分洗滌5 min×3次后,使用 ECL試劑盒(Pierce公司,美國)發(fā)光顯影,膠片曝光,掃描定量各條帶的相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重、FINS值、OGTT和胰島β細胞形態(tài)學(xué)的變化

與NC組相比,HC組小鼠體重升高了21.99%(P<0.05),FINS升高了181.82%(P<0.01,表1);OGTT曲線峰值明顯升高,峰值出現(xiàn)的時間點明顯后移,血漿中葡萄糖清除率明顯低于正常對照組,且3 h后血糖仍不能恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,并明顯高于基礎(chǔ)水平(圖1見彩圖頁Ⅲ)。從HE染色圖亦可見HE組胰島β細胞面積增大的同時胰島炎性浸潤表現(xiàn)明顯,邊緣輪廓清晰程度較差(圖2見彩圖頁Ⅲ)。

經(jīng)過6周有氧運動后,HE組與 HC組相比,小鼠體重降低了22.75%(P<0.01),FINS降低了41.9%(P<0.05,表1)。從OGTT曲線可以看到(圖1見彩圖頁Ⅲ),HE組與 HC組相比,峰值明顯下降,峰值出現(xiàn)的時間點前移,血漿中葡萄糖清除率已得到明顯改善且高于高脂安靜組,但3 h后血糖值仍高于基礎(chǔ)水平。從HE染色圖亦可見HE組胰島β細胞面積減少的同時胰島炎性浸潤表現(xiàn)輕于HC組,且邊緣輪廓較清晰(圖2見彩圖頁Ⅲ)。

Tab.1 Body weight and lipid level(,n=10)

Tab.1 Body weight and lipid level(,n=10)

NC:Normal chow control group;NE:Normal chow exercise group;HC:Highfat diet control group;HE:Highfat diet exercise group＊P<0.05,＊＊P<0.01vsNC;#P<0.05vsHC

Group Body weight(g)14-week Insulin(ng/ml)14-week NC 31.78±0.69 0.22±0.04 NE 30.28±1.71 0.26±0.04 HC 38.77±5.48＊ 0.62±0.26＊＊HE 29.95±1.12# 0.30±0.04#

2.2 骨骼肌mTOR mRNA和蛋白表達的變化

Fig.3 Effect of aerobic exercise on skeletal muscle mTOR mRNA(A)and protein expression(B)

骨骼肌mTOR mRNA和蛋白表達經(jīng)統(tǒng)計結(jié)果表明(圖3),骨骼肌mTOR mRNA和蛋白表達的趨勢基本一致,高脂飲食后HC組骨骼肌mTOR mRNA和蛋白分別較NC組升高了25.61%(P<0.05)和37.41%(P<0.01);有氧運動后,HE組骨骼肌mTOR mRNA和蛋白分別較 HC下降了16.27%(P<0.05)和19.22%(P<0.05)。由此可見,高脂飲食可以顯著性增加骨骼肌mTOR mRNA和蛋白的表達水平,而有氧運動又可以明顯降低HE組骨骼肌mTOR mRNA和蛋白的表達水平。

2.3 骨骼肌S6K1 mRNA和蛋白表達及 pS6K1-Thr389蛋白表達變化

Fig.4 Effect of aerobic exercise on skeletal muscle S6K1 mRNA(A)and protein expression(B)

骨骼肌S6K1 mRNA和蛋白及pS6K1-Thr389蛋白表達結(jié)果表明(圖4),高脂飲食喂養(yǎng)后HC組小鼠骨骼肌S6 K1 mRNA和蛋白較NC組分別升高了54.98%(P<0.01)和37.36%(P<0.01),pS6K1-Thr389蛋白表達水平比NC組高了671.20%(P<0.01);有氧運動后 HE比 HC小鼠骨骼肌中S6K1 mRNA和蛋白分別降低了22.02%(P<0.05)和25.37%(P<0.05),pS6K1-Thr389蛋白表達在有氧運動后下降了53.98%(P<0.05)。由此可見,高脂飲食可以明顯增加了骨骼肌總S6K1蛋白表達,而有氧運動又可以明顯降低高脂飲食組其蛋白的表達。

3 討論

mTOR目前被認為是一種營養(yǎng)素水平變化感受器,具有感受細胞外營養(yǎng)成分含量、能源物質(zhì)水平變化以及生長因子等信號的能力。目前最受關(guān)注的是在營養(yǎng)過?；蚋咧嬍硶r極易導(dǎo)致IR發(fā)生,且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)mTOR/S6K1信號通路可能參與了IR的發(fā)生過程。

當(dāng)機體營養(yǎng)素水平過剩時,高濃度的氨基酸/葡萄糖長期刺激,使得Insulin/PI3K/PK B通路下游的mTOR/S6K1通路長期處于激活狀態(tài),引起mTOR/S6K1過度表達而使 IRS1-Ser312、IRS1-Ser636/639或IRS1-Ser307發(fā)生過度磷酸化后抑制胰島素的信號傳導(dǎo)[1,2],從而嚴重干擾 Insulin/PI3K/PK B的胰島素信號傳導(dǎo)功能,引發(fā)機體產(chǎn)生 IR。而且這一過程依賴于mTOR/S6K1途徑的存在及過度表達。體外研究觀察發(fā)現(xiàn),在高胰島素濃度下,氨基酸可以刺激細胞引起IR,且還發(fā)現(xiàn)在氨基酸孵育過的細胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運能力下降,可能是mTOR通路起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。由此可以推斷,mTOR通路的激活在 IR的發(fā)生中也起著重要作用。

Leila等人[4]的研究發(fā)現(xiàn)4周高脂飲食誘導(dǎo) IR的大鼠空腹時肝臟和骨骼肌中 mTOR-Ser2448及S6K1-Thr421/Ser424磷酸化表達明顯高于正常飲食的大鼠。在本研究中,經(jīng) 14周高脂飲食喂養(yǎng)后,HC組FINS值顯著升高,且發(fā)現(xiàn)機體對葡萄糖的耐受能力明顯降低,并伴有體重的增加,結(jié)果表明小鼠存在著明顯的高胰島素血癥。同時發(fā)現(xiàn)HC組小鼠骨骼肌組織中mTOR及S6K1的mRNA NC組有明顯上調(diào),而且還發(fā)現(xiàn)HC組S6K1磷酸化蛋白表達明顯高于NC組。因此說明,高脂飲食激活了mTOR能量感受器,從而調(diào)節(jié)下游的 S6K1基因和蛋白的表達,從而使得機體產(chǎn)生了嚴重的IR癥狀。

目前的研究已證實,有氧運動在預(yù)防和治療IR等相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要的作用。本實驗對高脂飲食所誘導(dǎo)的 IR小鼠施以6周強度為75%VO2max的有氧跑臺訓(xùn)練,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠在運動后體重降低了22.75%(P<0.01),FINS水平也降低了41.9%(P<0.05),此時說明機體已改善了高胰島素血癥,同時發(fā)現(xiàn)機體對葡萄糖的耐受能力也明顯增強,從形態(tài)學(xué)分析,運動減輕了胰島β細胞的增生和炎性浸潤癥狀。由此可見強度為75%VO2max的6周有氧耐力運動能夠明顯改善 IR狀態(tài)。

關(guān)于mTOR和S6K1在有氧運動改善IR過程中的作用,多數(shù)學(xué)者已證明有氧運動是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)后抑制mTOR和S6K1活性來實現(xiàn)的。主要表現(xiàn)為運動后AMPK活性顯著增高[5～8],活化后的AMPK可使mTOR-Ser2446發(fā)生磷酸化,從而抑制mTOR-Ser2448發(fā)生磷酸化,降低S6K1磷酸化的能力[9]。David[10]等人在對8月齡大鼠皮下注射AICAR(AMPK激動劑)或生理鹽水 (對照)40min后,對趾長伸肌進行高頻電刺激使其處于伸長狀態(tài)達22 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用AICAR處理后,趾長伸肌在伸長后細胞內(nèi)AMPK-Thr172和ACC-Ser79均呈顯著性升高的同時卻明顯抑制了pS6K1-Thr389蛋白的表達。在長期有氧運動也得到了同樣的結(jié)果,我們的實驗已經(jīng)證實在長期有氧運動后磷酸化蛋白AMPK-Thr172和ACC-Ser79均呈顯著升高。本實驗小鼠在進行6周有氧跑臺訓(xùn)練后其骨骼肌pS6K1-Thr389蛋白表達也呈顯著性下降趨勢。提示我們,AMPK活性增強抑制了pS6K1-Thr389蛋白表達。

長期營養(yǎng)過?？梢赃^度激活mTOR和S6K1信號通路從而使得IRS-1絲氨酸殘基磷酸化增加,導(dǎo)致Insulin/PI3K/PK B的胰島素信號通路受損。然而長期耐力訓(xùn)練可以提高IR骨骼肌對胰島素的敏感性[1]。本實驗發(fā)現(xiàn)mTOR、S6K1和pS6K1-Thr389蛋白表達在長期有氧運動后呈顯著性下降?？傊?本實驗證實IR小鼠在有氧運動后mTOR和S6K1及其磷酸化蛋白的表達下降,說明長期的有氧訓(xùn)練可能通過調(diào)節(jié)mTOR/S6K1信號通路來改善IR癥狀。

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