王貴紅，鄭蘭東

（河南大學第一附屬醫(yī)院普通外科，河南開封 475001）

結腸癌CA-Ⅱ的表達及其臨床意義

王貴紅，鄭蘭東

（河南大學第一附屬醫(yī)院普通外科，河南開封 475001）

目的：探討結腸癌中碳酸酐酶-Ⅱ（CA-Ⅱ）的表達與腫瘤的侵襲、轉移和生物學行為的關系。方法：采用免疫組化SP法測定40例結腸癌中CA-Ⅱ基因導入到結腸癌細胞中，觀察細胞生物學行為的改變。結果：CA-Ⅱ在癌旁正常組織中表達陽性率為100%，在結腸癌組織中表達陽性率為30%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。結腸癌組織中CA-Ⅱ的表達與年齡、性別無關（P＞0.05）；與組織分型、分化程度和淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05）。將CA-ⅡcDNA克隆轉染HR-8384細胞后，癌細胞侵襲、趨化運動能力及耐受性均明顯減弱。結論：CA-Ⅱ在結腸癌中的表達影響腫瘤侵襲、轉移和生物學行為。

結腸癌；碳酸酐酶－Ⅱ；腫瘤

碳酸酐酶Ⅱ（CA-Ⅱ）是含鋅金屬酶－碳酸酐酶家族中的一員，因其分布廣泛、較高的催化效率和重要的生理學作用，目前已成研究的熱點。但關于CA-Ⅱ與結腸癌之間關系的研究甚少。本研究采用免疫組化SP法，觀察結腸癌和癌旁正常組織中CA-Ⅱ的表達情況，以及CA-Ⅱ與臨床病理因素之間的關系，同時研究CA-Ⅱ對結腸癌細胞生物學行為的改變，從而為篩選臨床腫瘤標志物和治療靶標提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本院2009年8月～2010年3月手術切除結腸癌標本40例，其中，男22例，女 18例；年齡 45～82（平均 62）歲。 術后病理報告：乳頭狀腺癌23例，管狀腺癌11例，黏液癌4例，未分化癌2例。高、中分化癌16例，低、未分化癌24例。淋巴轉移21例，無淋巴結轉移19例。術前均未作放、化療。癌旁正常組織作為對照。

1.2 免疫組織化學染色

采用免疫組化SP法，DAB染色。CA-Ⅱ多克隆抗體（兔抗人）購自Santa Cruz公司。SP試劑盒購自美國Zymed公司。工作濃度為1∶100。用已知的結腸癌CA-Ⅱ陽性切片作陽性對照，用PBC代替－抗作陰性對照。按照SP試劑盒所附的說明書進行操作。

1.3 免疫組化結果的判斷

CA-Ⅱ陽性標準為細胞膜染成棕黃色或棕褐色，取染色明顯的部位，高倍鏡下取4個不同視野連續(xù)計數200個細胞。判斷如下：陽性細胞數＜25%或無顯色為（－），25%～50%（＋），＞50%（++）。

1.4 細胞轉染

用常規(guī)逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）方法從正常結構黏膜組織和淋巴結轉移中克隆CA-ⅡcDNA，構建真核表達載體PCDNA3.1－CA-Ⅱ。采用脂質體轉染法將PCDNA3.1－CA-Ⅱ轉染結腸癌HR－8384細胞。

1.5 觀察結腸癌細胞生物學行為的改變

1.5.1 腫瘤細胞的侵襲能力 細胞侵襲基底膜實驗在Transwell小室（Costar公司）中進行。統計視野中的細胞數目，以侵襲細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.5.2 腫瘤細胞的趨化運動能力 在聚脂酸濾膜（8 μm孔徑）上下表面分別覆蓋5 μm纖粘連蛋白（promege公司），黏附于Transwell小室。細胞株經EDTA/PBS消化后約2.5×105個細胞進入到Transwell小室中，統計視野中的細胞數目，以細胞的相對數目表示腫瘤細胞的趨化運動能力。

1.6 四唑鹽比色試驗（MTT）

以轉染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的細胞為實驗組；以未轉染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的細胞為對照組。分別觀察氟尿嘧啶及奧沙利鉑藥物對其的抑制率。抑制率＝（1－實驗組吸光度值/空白對照組的光度值）×100%。

1.7 統計學處理

采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CA-Ⅱ在結腸癌組織中的表達

CA-Ⅱ在結腸癌組織中的表達陽性率為30%，陰性率為70%。癌旁正常組織中的陽性表達率為100%，二者差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 CA-Ⅱ在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達（n）

2.2 結腸癌組織CA-Ⅱ的表達與臨床病理因素之間的關系

結腸癌組織中CA-Ⅱ的表達陰性率與年齡、性別無關（P＞0.05），與組織分型、分化程度和淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05），見表 2。

表2 結腸癌組織CA-Ⅱ的表達與臨床病理因素之間的關系（n）

2.3 轉染CA-Ⅱ癌細胞的侵襲和趨化運動能力

轉染CA-Ⅱ癌細胞的侵襲能力、趨化運動能力較未轉染癌細胞明顯下降（P＜0.05），MTT實驗顯示氟尿嘧啶和奧沙利鉑對轉染CA-Ⅱ的癌細胞的抑制率較未轉染癌細胞明顯增強（P＜0.05）。

3 討論

CA-Ⅱ是一個28KD的胞漿內酶，分布廣泛，幾乎在所有組織或器官的細胞漿內均有表達[1]。在結腸組織中，它定位于結腸的內皮和上皮細胞，促進遠端結腸上皮分泌——H+和HCO3-，有利于機體水、電解質及酸堿平衡。同時，CA-Ⅱ可導致腫瘤細胞功能紊亂，甚至腫瘤細胞的死亡[2]。若缺乏CA-Ⅱ，腫瘤組織中pH值下降，氧分壓降低，腫瘤細胞代謝障礙，導致腫瘤細胞呈失控性生長[3]。因此，CA-Ⅱ通過改變腫瘤細胞的微環(huán)境，如pH值下降、水電解質及酸堿平衡失調或低氧分壓等，影響代謝過程（如糖原合成，脂肪酸和氨基酸的合成等），從而成為抗腫瘤因子—抑瘤基因[4]。同時研究發(fā)現大腸癌組織CA陽性組的預后明顯好于陰性組[5-6]。因此有學者提出CA-Ⅱ可作為一種腫瘤標志物[7]。

本研究發(fā)現CA-Ⅱ在結腸癌組織中的表達陽性率為30%，陰性率為70%，而癌旁正常組織中的表達陽性率為100%，說明CA-Ⅱ在結腸癌級織中的表達下降。同時，還發(fā)現CA-Ⅱ的表達陰性率與組織學分型、分化程度和淋結轉移有關聯。為了進一步證明CA-Ⅱ可能為一種高癌基因，筆者采用轉染方法，將轉染CA-Ⅱ基因的結腸癌細胞和未轉染細胞分別觀察腫瘤細胞的侵襲能力、細胞趨化運動能力以及對抗癌藥物的反應發(fā)現二者有明顯差異。

這進一步證明CA-Ⅱ的表達與結腸癌的侵襲、轉移和生物學行為密切相關，CA-Ⅱ在抑制結腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這與碳酸酐酶既可作為篩選結腸癌的有用指標，又與碳酸酐酶可用于防治結腸癌的復發(fā)轉移的研究相一致[8]。有關CA-Ⅱ作為結腸癌的抑癌基因更明確的機制尚待進一步研究。

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The expression of CA-Ⅱin colonic cancer and its clinical significance

WANG Guihong,ZHENG Landong
(Department of General Surgery,First Affiliated Hospital of Henan University,Henan Province,Kaifeng 475001,China)

Objective:To evaluate the expression of carbonic anbydraseⅡ (CA-Ⅱ)in colonic carcer associated with invasion,metastasis and biological behavior.Methods:The immunohisto-chemistry was used to detect the expression of CA-ⅡcDNA,and the changes of cell biological behavior was observed.Results:The positive rate of CA-Ⅱin side tissue of colonic cancer was 100%and in colonic cancer was 30%,the contrastive difference was visible(P＜0.05).The expression of CA-Ⅱ in colonic carcer was not related to age and sex(P＞0.05),and related to tissue type,different grade and lymph node metstasis(P<0.05).After transfection with human cDNA,the love cells changed obviously with reduction in invasion,chemotary motor ability and tolerance.Conclusion:The expression of CA-Ⅱin colonic cancer affect the invasion,metastasis and biological behavior.

Colonic cancer;Carbonic anhydvaseⅡ;Cancer

R574.62

A

1674-4721（2010）09（a）-005-02

王貴紅（1971-），男，主治醫(yī)師，在職研究生學歷（鄭州大學醫(yī)學院2001級），從事普通外科腫瘤基礎與臨床研究。鄭蘭東，男，主任醫(yī)師；研究方向：普通外科腫瘤基礎與臨床研究。

2010-07-12）