郝文波,李 宏,鄧小英,廖小青,李 明,羅樹(shù)紅

惡性瘧原蟲(chóng)網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)合蛋白同源體5 F1段的克隆、表達(dá)及初步鑒定*

郝文波,李 宏,鄧小英,廖小青,李 明,羅樹(shù)紅

目的克隆表達(dá)惡性瘧原蟲(chóng)網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)合蛋白同源體5(PfRh5)F1片段,并評(píng)價(jià)其抗原性。方法PCR擴(kuò)增目的基因片段,克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建PfRh5F1/pET28a原核表達(dá)載體。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的基因,SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物,并用Western Blot檢測(cè)其抗原性。結(jié)果成功構(gòu)建了PfRh5F1/pET28a原核表達(dá)系統(tǒng),并在大腸桿菌中以包涵體形式高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物能被惡性瘧原蟲(chóng)感染患者血清識(shí)別,而不能被間日瘧原蟲(chóng)感染患者及正常人血清識(shí)別。結(jié)論惡性瘧原蟲(chóng)PfRh5 F1段在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

惡性瘧原蟲(chóng);網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)合蛋白同源體5;克隆;表達(dá)

惡性瘧原蟲(chóng)網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)合蛋白同源體 5(PfRh5)是惡性瘧原蟲(chóng)(P f)PfRh家族的一個(gè)新成員,位于裂殖子頂端的棒狀體內(nèi),最近研究發(fā)現(xiàn)該蛋白是參與Pf入侵的一個(gè)重要蛋白,可與紅細(xì)胞上尚未識(shí)別的一個(gè)新的糖基化的受體結(jié)合〔1-2〕,而且該蛋白對(duì)蟲(chóng)體的生存具有關(guān)鍵作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)克隆表達(dá)了PfRh5蛋白的F1段(K31-F174),該片段預(yù)測(cè)與紅細(xì)胞上受體結(jié)合相關(guān),為進(jìn)一步研究該蛋白在紅細(xì)胞入侵中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 載體pET28a為Pharmacia產(chǎn)品、大腸桿菌宿主菌Rosetta為本室保存。

1.1.2 蟲(chóng)株與抗體 惡性瘧原蟲(chóng)HCC1/HN株由本室保種;惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)病人血清由云南省西雙版納傣族自治州疾病預(yù)防控制中心提供;H RP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.3 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、瓊脂糖凝膠電泳DNA純化試劑盒、His-Ni-NTA親和層析填料購(gòu)自QIAGEN公司;限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Hind III,T4DNA連接酶為NEB產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;,其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 惡性瘧原蟲(chóng)的培養(yǎng) 參考 T rager-Jensrn〔4〕等的方法,待原蟲(chóng)密度達(dá)到5%后離心收集含蟲(chóng)血。

1.2.2 惡性瘧原蟲(chóng)基因組DNA的提取 按QIAGEN基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)PfRh5基因F1片段根據(jù)惡性瘧原蟲(chóng)(3D7株)PfRh5基因序列,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物,F1P1:5'-ACGTCGGATCCAAAACGAAGAATCAA -3',F1P2:5'-CGAGCAAGCTTAAAATCCAAATGTCCTTC-3',并分別引入BamH I和Hind III酶切位點(diǎn),由深圳華大基因科技股份有限公司合成。以惡性瘧原蟲(chóng)染色體DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)在50μ l體系中進(jìn)行,循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性3min,95℃變性 1min,52℃退火 45s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán)后,72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.4 PfRh5F1/pET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物純化后與質(zhì)粒pET28a DNA分別用BamH I和Hind III雙酶切,純化酶切產(chǎn)物,在T4DNA連接酶作用下,16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 Rosetta感受態(tài)細(xì)菌。

1.2.5 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 通過(guò)BamH I和Hind III雙酶切及PCR篩選陽(yáng)性重組克隆菌,送深圳華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.6 重組載體的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒PfRh5F1/pET28a轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌 Rosetta中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),收獲菌體,SDS-PAGE電泳分析表達(dá)情況。收集的菌體經(jīng)超聲破菌、離心、變性、復(fù)性等過(guò)程處理后,過(guò)His-Ni-NTA親和層析柱純化。

1.2.7 Western blot分析重組蛋白的抗原性 重組蛋白純化后進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完畢后,將凝膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)移儀(美國(guó)BIO-RAD公司)轉(zhuǎn)移至PVDF膜,常規(guī)5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜,分別以惡性瘧原蟲(chóng)感染患者、間日瘧原蟲(chóng)感染患者和正常人血清為一抗(1∶1 000),室溫1h,PBS洗滌后加HRP標(biāo)記的羊抗人二抗室溫孵育2h,PBS漂洗后ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物,可見(jiàn)在400bp和500bp之間有一DNA片段,與目的基因預(yù)期一致,見(jiàn)圖1。

2.2 PfRh5F1/pET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定從連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落,提取質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR及BamH I+Hind III雙酶切鑒定,陽(yáng)性重組克隆能擴(kuò)增出429bp的目的片段(圖2),用BamH I+Hind III雙酶切后可產(chǎn)生5 300 bp及429bp兩條帶(圖3),表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。將經(jīng)酶切和PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌,送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI中由Gen-Bank提供的基因序列進(jìn)行比對(duì),堿基序列完全正確。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化 將陽(yáng)性克隆菌落及陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體,常規(guī)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),與空載體對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果相比,PfRh5F1/pET28a/Rosetta菌體在相對(duì)分子量約21.8kDa位置有的較強(qiáng)的表達(dá)條帶出現(xiàn)。菌體經(jīng)超聲波破菌后,分別取上清和沉淀少許,常規(guī)處理樣品并進(jìn)行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要出現(xiàn)在沉淀中,因此目的蛋白是以包涵體的形式表達(dá)(圖 4)。包涵體經(jīng)變性、復(fù)性處理后,過(guò)His-Ni-NTA親和層析柱純化,得到分子量約20kDa,純度約90%的重組蛋白。

2.4 重組蛋白的抗原性分析 Western blot結(jié)果顯示,純化的重組表達(dá)蛋白能夠被惡性瘧原蟲(chóng)感染患者血清識(shí)別,而不被間日瘧原蟲(chóng)感染患者及正常人血清識(shí)別,見(jiàn)圖5。

3 討 論

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人體健康的寄生蟲(chóng)病。目前,全世界范圍內(nèi)的瘧疾發(fā)病率正在增高〔5〕。隨著P f對(duì)多種抗瘧藥產(chǎn)生抗性,瘧疾死亡病例逐漸增多,開(kāi)發(fā)出新的有效的藥物和疫苗已勢(shì)在必行。

新藥及疫苗的開(kāi)發(fā)離不開(kāi)對(duì)P.f致病機(jī)制的深入理解。裂殖子入侵紅細(xì)胞是瘧原蟲(chóng)在體內(nèi)繁殖和對(duì)宿主致病的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程,阻斷該過(guò)程是瘧疾防治的一個(gè)重要策略〔6-7〕。PfRh5是最近發(fā)現(xiàn)的參與Pf入侵的一個(gè)重要蛋白,抗PfRh5抗體在體外具有抑制P f入侵的作用,重組PfRh5蛋白可以被瘧原蟲(chóng)免疫血清及瘧區(qū)暴露人群血清識(shí)別,提示P f裂殖子與紅細(xì)胞之間存在一條新的入侵途徑〔1,3〕。鑒定PfRh5與紅細(xì)胞上的受體的相互作用,有助于我們更深入的理解Pf裂殖子的入侵機(jī)制,同時(shí)也可為研制P f紅內(nèi)期亞單位疫苗提供一個(gè)潛在的候選抗原。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆、表達(dá)了惡性瘧原蟲(chóng)PfRh5蛋白的F1段(K31-F174),該片段預(yù)測(cè)為PfRh5與受體結(jié)合的重要區(qū)域,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性處理后,過(guò)His-Ni-NTA親和層析柱純化,獲得了純度較高的重組蛋白產(chǎn)物。通過(guò)Western blot分析重組蛋白的抗原性,結(jié)果重組蛋白能夠與惡性瘧原蟲(chóng)感染患者血清發(fā)生反應(yīng),而不與間日瘧原蟲(chóng)感染患者和正常人血清反應(yīng),說(shuō)明重組蛋白具有良好的抗原性,可能具有良好的生物學(xué)活性,這將為制備抗PfRh5蛋白的單克隆抗體及進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

〔1〕Rodriguez M,Lustigman S,Montero E,et al.PfRH5:a novel reticulocyte-binding family homolog ofPlasmodium falciparumthat binds to the erythrocyte,and an investigation of its receptor〔J〕.PLoS ONE,2008,3(10):e3300.

〔2〕Baum J,Chen L,Healer J,et al.Reticulocy te-binding protein homologue 5-an essential adhesion involved in invasion of human ery throcytes byPlasmodium f alciparum〔J〕.Int J Parasitol,2009,39(3):371-380.

〔3〕Hayton K,Gaur D,Liu A,et al.Erythrocy te binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways ofPlasmodium f alciparuminvasion〔J〕.Cell Host Microbe,2008,4(1):40-51.

〔4〕Trager W,Jensen JB.Human malaria parasites in continuous culture〔J〕.Science,1976,193(4254):673-675.

〔5〕Snow RW,Guerra CA,Noor AM,et al.T he global distribution of clinical episodes ofPlasmodium f alciparum malaria〔J〕.Nature,2005,434:214 217.

〔6〕Soldati D,Foth BJ,Cowman AF,et al.Molecular and functional aspects of parasite invasion〔J〕.T RENDS in Parasitology,2004,20(12):568.

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Cloning,expression and identification of reticulocyte-binding protein homologue 5 F1 fragment inPlasmodium falciparum

HAO Wen-bo,LI Hong,DENG Xiao-ying,LIAO Xiao-qing,LI Ming,LUO Shu-hong
(Institute of Antibody Engineering,Schoolof Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou510515,China)

In order to clone and express reticulocyte-binding protein homologue 5(PfRh5)F1 fragment gene ofPlasmodium falciparum,the 429bp PfRh5 gene(91-519)was specifically amplified by polymerase chain reaction and cloned into pET28a(+)vector.The recombinant plasmid was then transformed and induced to express inE.coliRosetta.The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and Western Blot respectively.And the expressed protein was insoluble with a size of about 21.9 kDa as predicted.Also,it exhibited a specific reaction with immune sera obtained from patients with Pf maleria.These results demonstrate that the PfRh5 F1 fragment has been successfully expressed and the expressed protein has certain antigenicity.

Plasmodium falciparum;reticulocyte-binding protein homologue 5;clone;expression

R382.3

A

1002-2694(2010)07-0624-03

*國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973專(zhuān)項(xiàng)(No.2007CB513101)和國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30200238)聯(lián)合資助

羅樹(shù)紅,Email:shluo815@yahoo.com

南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,廣州 510515

2010-03-15;

2010-04-20