劉碧源,曾慶仁,余 平,李艷琴,魏 琦,楊勝輝,劉 彥,張順科,蔡力汀

2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院及醫(yī)學(xué)院,衡陽(yáng) 421001

不同免疫途徑對(duì)Sj童蟲(chóng)細(xì)胞型免疫原誘生的保護(hù)性效果及抗體應(yīng)答差異*

劉碧源1,2,曾慶仁1,余 平1,李艷琴1,魏 琦1,楊勝輝1,劉 彥1,2,張順科1,蔡力汀1

目的比較研究小鼠經(jīng)不同途徑接種日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum,Sj)童蟲(chóng)原代細(xì)胞(primary juvenile worm cells,pJCs)后所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果,尋找其合適的免疫途徑。方法將pJCs經(jīng)皮下或靜脈注射途徑免疫昆明小鼠,間隔2w共免疫3次,末次免疫后第4w,與對(duì)照組同時(shí)經(jīng)腹部皮膚感染尾蚴30±2尾/鼠,比較三組小鼠的肝臟蟲(chóng)卵數(shù)及蟲(chóng)卵肉芽腫的大小、成蟲(chóng)數(shù)、蟲(chóng)體大小。同時(shí)在第2、3次免疫前及攻擊感染前1d,小鼠尾靜脈采血,用ELISA法檢測(cè)抗pJCs-IgG水平。結(jié)果pJCs免疫小鼠后,與PBS對(duì)照組比,靜脈免疫組的減蟲(chóng)率為48.53%、肝卵減少率為54.54%、蟲(chóng)體平均重量減少率為29.62%(P＜0.01)、蟲(chóng)卵肉芽腫面積減少率為36.8%,而皮下免疫組分別為41.28%、43.19%、23.08%、31.2%。IgG抗體水平也是靜脈注射組高(PBS組,P＜0.01;皮下注射組,P＜0.05)。結(jié)論日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞免疫原通過(guò)皮下和靜脈注射均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)日本血吸蟲(chóng)的免疫保護(hù)力,其中靜脈注射誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效應(yīng)最強(qiáng),提示通過(guò)靜脈注射日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞是可行有效的免疫途徑。

日本血吸蟲(chóng);童蟲(chóng)原代細(xì)胞;免疫應(yīng)答;免疫保護(hù)

2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院及醫(yī)學(xué)院,衡陽(yáng) 421001

血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)病。雖然采取綜合的吡喹酮化療和滅螺等治理措施,但是目前仍有幾百萬(wàn)人群和各種家畜受到感染。因此,血吸蟲(chóng)疫苗的研究與開(kāi)發(fā)仍然是血吸蟲(chóng)病防治的重點(diǎn)之一。迄今為止,WHO推薦的6種最具有希望的血吸蟲(chóng)疫苗候選分子免疫動(dòng)物后,均不能穩(wěn)定地獲得40%以上的保護(hù)力。我們課題組一直致力于日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng),取得了重要的研究成果〔1-2〕。在此基礎(chǔ)上觀(guān)察了日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞免疫小鼠后能誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的免疫保護(hù)性效果。同時(shí)對(duì)該免疫原的免疫部位、免疫次數(shù)和免疫劑量進(jìn)行了優(yōu)化〔3-5〕。本研究中,我們選擇前期免疫保護(hù)作用顯著的12d日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞作為免疫原,通過(guò)靜脈注射和皮下注射兩種不同的途徑進(jìn)行免疫接種,比較它們?cè)谔禺愋缘捏w液免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)中的作用,為全面評(píng)價(jià)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞型疫苗的免疫效果提供理論依據(jù),也為疫苗的改進(jìn)和研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲(chóng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)陽(yáng)性釘螺由湖南省血吸蟲(chóng)病防治所提供。健康6～8w齡雌性昆明小鼠、新西蘭兔均購(gòu)自中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部。

1.2 免疫原的制備免疫原的制備參照文獻(xiàn)〔3〕:用門(mén)靜脈灌注法從日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染兔收集第12d的童蟲(chóng),用含抗生素(1 000IU/mL青霉素G和1 000μ g/mL鏈霉素)無(wú)菌 PBS反復(fù)洗滌后,將蟲(chóng)體在300目網(wǎng)篩上輕輕研磨,加入少許PBS后過(guò)濾掉蟲(chóng)體碎片。含細(xì)胞濾液用于免疫原的制備:收集沉淀細(xì)胞用PBS離心洗滌3次,然后用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL為原代童蟲(chóng)細(xì)胞(primary juvenile worm cells,pJCs),直接用于第1次免疫或經(jīng)液氮凍存后復(fù)蘇、洗滌,用于第2、3次免疫。免疫前,所有細(xì)胞用PBS調(diào)整濃度為2×107個(gè)/mL。

1.3 免疫方案及攻擊感染30只昆明小鼠隨機(jī)分為pJCs雙側(cè)腹股溝皮下多點(diǎn)注射組、pJCs尾靜脈注射組、PBS皮下注射組。pJCs免疫原為12d的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞量約為2×107個(gè)/mL,接種量為100μ L/鼠/次 ,對(duì)照組注射 PBS 100μ L/次/鼠,各組小鼠平行在0、14和28d分別進(jìn)行1次免疫。第2、3次免疫前及攻擊感染前1d,均作小鼠尾靜脈采血,用ELISA法檢測(cè)抗pJCs-IgG水平。末次免疫后第4w經(jīng)腹部皮膚感染尾蚴30±2尾/鼠。

1.4 保護(hù)性效果的測(cè)定感染后第42d,乙醚麻醉、眼眶放血后剖殺小鼠,用肝門(mén)靜脈灌注法沖蟲(chóng),分組收集蟲(chóng)體,計(jì)算減蟲(chóng)率;將收集的各組蟲(chóng)體稱(chēng)重,觀(guān)察蟲(chóng)體發(fā)育情況。灌注后取鼠肝,部分用于病理組織切片測(cè)量肝蟲(chóng)卵肉芽腫大小,部分用于肝蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)方法,每鼠取1g肝組織勻漿,置于5mL 4%KOH中,37℃搖勻消化過(guò)夜,取 200μ L肝組織消化混懸液涂片鏡下計(jì)算蟲(chóng)卵,得出每克肝卵數(shù)(liver eggs per gram,LEPG)。減蟲(chóng)率、LEPG減少率均按下列公式計(jì)算:LEPG減少率(減蟲(chóng)率)=[(對(duì)照組的平均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組的平均數(shù))/對(duì)照組的平均數(shù)]×100%。組織病理學(xué)觀(guān)察,每鼠取肝中葉按常規(guī)固定,石蠟包埋、切片后作蘇木素-伊紅(HE)染色,用Motic Images Advanced 3.2病理圖象分析系統(tǒng)測(cè)量所有單個(gè)含毛蚴的蟲(chóng)卵的肉芽腫面積,取各組平均值進(jìn)行比較分析。

1.5 ELISA檢測(cè)特異性IgG抗體水平 于第2、3次免疫前及攻擊感染前1d收集各試驗(yàn)組小鼠的血清,用ELISA法檢測(cè)特異性抗血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞IgG抗體。先將12d血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)反復(fù)凍融、超聲粉碎,離心取上清為可溶性童蟲(chóng)細(xì)胞抗原(soluble juvenile worm antigen,SJWA)。SJWA 用pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋,按1μ g/孔濃度包被96孔板,4℃過(guò)夜,封閉、洗滌,用1∶100稀釋的各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清37℃孵育2h。所有樣本均設(shè)復(fù)孔,同時(shí)用日本血吸蟲(chóng)感染鼠血清和未感染鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。PBST洗滌,加入 1∶4 000的H RP-羊抗鼠 IgG,加TMB底物室溫顯色15min,用5%H2SO4終止,置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Student'st檢驗(yàn),P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 減蟲(chóng)率、肝卵減少率 pJCs分別通過(guò)腹股溝皮下注射和尾靜脈注射的方法免疫小鼠后的減蟲(chóng)率、減卵率見(jiàn)表1。從表1中可知,與PBS對(duì)照組比,皮下注射組的減蟲(chóng)率為41.28%、減卵率為43.19%(P＜0.05),靜脈注射組的減蟲(chóng)率和減卵率分別為48.53%和54.54%(P＜0.01)。靜脈注射組與皮下注射組比,兩者差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 蟲(chóng)體平均重量減少率 從表2可知,與PBS對(duì)照組比,皮下注射組的蟲(chóng)體重量平均減少率為23.08%、靜脈注射組的為26.92%,差異有顯著性(P＜0.01)。靜脈注射組與皮下注射組相比差異有顯著性(P＜0.05)。

2.3 肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積減少率 用Motic Images Advanced 3.2病理圖象分析系統(tǒng)對(duì)pJCs不同接種途徑免疫鼠肝組織內(nèi)蟲(chóng)卵肉芽腫大小進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果見(jiàn)表3。各免疫組與PBS對(duì)照組比,肝卵肉芽腫面積顯著減少(P＜0.05),但靜脈注射組和皮下注射組二者間的差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

表1 各組的蟲(chóng)荷數(shù)和每克肝卵數(shù)Table 1 Wormburden and LEPG level induced by different immunization routes

表2 各組蟲(chóng)體的發(fā)育情況Table 2 Worm average weights induced by different immunization routes

表3 各免疫組鼠肝卵肉芽腫的面積減少率Table 3 Mean areas of granulomas on liver slides from mice induced by different immunization routes

2.4 抗體水平 圖1可知,免疫后第2w各免疫組IgG抗體開(kāi)始逐漸上升,到攻擊感染前達(dá)最高水平,均明顯高于PBS對(duì)照組(P＜0.01);靜脈注射組誘導(dǎo)的抗體水平也明顯高于皮下注射組(P＜0.05)。

圖1 各免疫組及對(duì)照組小鼠抗pJCs-IgG動(dòng)態(tài)水平Fig.1 Kinetics of total anti-pJCIgG in pJCs immunized mice by different routes

3 討 論

抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答及免疫應(yīng)答類(lèi)型受許多因素的影響,如免疫途徑、抗原緩釋以及抗原的物理狀態(tài)等〔6〕。我們?cè)谇捌谘芯恐幸呀?jīng)優(yōu)化了童蟲(chóng)細(xì)胞抗原的免疫劑量和免疫次數(shù)〔4-5〕。為獲得更理想的保護(hù)性效果,本研究進(jìn)一步優(yōu)化免疫途徑,以選擇能誘導(dǎo)高保護(hù)性的適宜免疫途徑。選用前期研究中免疫效果明顯的12d日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射和腹股溝多點(diǎn)皮下注射兩條途徑分別免疫小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與 PBS對(duì)照組(感染對(duì)照)比,兩次實(shí)驗(yàn)經(jīng)靜脈注射免疫鼠的平均減蟲(chóng)率、肝卵減少率和蟲(chóng)體平均重量減少率分別為48.53%、54.54%和26.92%(P＜0.01),該抗攻擊感染效果與平行試驗(yàn)的皮下注射組所獲結(jié)果比,其差異有顯著性(P＜0.05)。在抗體應(yīng)答方面,IgG抗體水平也是靜脈注射組高(與PBS比,P＜0.01;與皮下注射組比,P＜0.05)。該結(jié)果表明,用12d童蟲(chóng)細(xì)胞通過(guò)靜脈注射和皮下注射的方法免疫小鼠均可獲得顯著的保護(hù)性效果和較高的抗體水平,尤其是靜脈注射組的效果明顯優(yōu)于皮下注射組。值得注意的是,我課題組之前報(bào)道的皮下免疫效果均高于本次,其原因既可能與細(xì)胞制備批間差異(如細(xì)胞活力)有關(guān),也可能與不同批動(dòng)物差異有關(guān)〔3-5〕。有關(guān)免疫途徑對(duì)疫苗免疫效果的影響,研究報(bào)道并不完全一致,有的甚至互為矛盾。這可能是不同接種途徑所涉及的抗原提呈不同,免疫效果不同,因而可產(chǎn)生不同類(lèi)型、不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。Porgador and Gilboa〔7〕報(bào)道抗原肽刺激的DC疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)腫瘤的保護(hù)性免疫。Eggert等〔8〕研究DC疫苗經(jīng)皮下、腹腔和靜脈輸注后在小鼠體內(nèi)的分布,結(jié)果顯示:靜脈注射后DC迅速分布到肺組織,48h后以脾臟分布最多;而皮下和腹腔注射后DC在肺、肝和脾臟的分布明顯要低。Power〔9〕的研究結(jié)果也表明靜脈注射免疫途徑效果要好。這可能是由于靜脈注射的抗原容易更快地到達(dá)二級(jí)淋巴器官,迅速與免疫細(xì)胞接觸而發(fā)揮更好的保護(hù)性作用。這些研究報(bào)道與我們的研究結(jié)果一致,表明通過(guò)靜脈注射免疫小鼠也是日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞型疫苗一條可行有效的免疫途徑。

〔1〕龔燕飛,曾慶仁,張祖萍,等.日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的初步研究〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志,2005,21(2):159-163,124.

〔2〕劉偉,曾鐵兵,曾慶仁,等.日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體外傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定〔J〕.中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志,2006,24(5):395-397.

〔3〕曾慶仁,林雪遲,龔燕飛,等.一種新型日本血吸蟲(chóng)疫苗(童蟲(chóng)活細(xì)胞)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效保護(hù)性免疫力的研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(14):84-97.

〔4〕Zeng T B,Cai L T,Zeng Q R,et al.Immunization of mice with cells from juvenile worms ofSchistosoma japonicumprovides immunoprotection against schistosomiasis〔J〕.Science in China Series C:Life Sciences,2007,50(6):1-9.

〔5〕Cai L,Zeng T,Zeng Q,et al.Schistosoma japonicum:protective immunity induced by schistosomulum-derived cells in a mouse model〔J〕 .J Parasitol,2008,94(2):395-403.

〔6〕金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:32.

〔7〕 Porgador A,Gilboa E.Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocy tes〔J〕.J Exp Med,1995,182(1):255-260.

〔8〕Eggert AA,Schreurs M W,Boerman OC,et al.Biodistribution and vaccine efficiency of murine dendritic cells are dependent on the route of administration〔J〕.Cancer Res,1999,59(1):3340-3345.

〔9〕Power CA,Wei G,Bretscher PA.Mycobacterial dose defines the Th1/Th2 nature of the immune response independently of whether immunization is administered by the intravenous,subcutaneous,or intradermal route〔 J〕.Infection and Immunity,1998,66(12):5743-5750.

Comparison of the immune protective effect and antibody response of primary cells fromschistosomulumby two different immunization routes in mice

LIU Bi-yuan1,2,ZENG Qing-ren1,YU Ping1,LI Yan-qin1,WEI Qi1,YANG Sheng-hui1,LIU Yan1,2,ZHANG Shun-ke1,CAI Li-ting1

(1.Cell&Molecular Biological Experiment Center and Department of Immunology and Parasitology,Xiangya Medical School,the Central South University,Changsha410013,China;
2.School of Public Health and Medicine,University of South China,Hengyang421001,China)

In order to observe the influence of immunization route on the immune protective effects induced by primary juvenile worm cells(pJCs),Kunming mice were inoculated intravenously or subcutaneously with pJCs from 12 day-oldSchistosoma japonicumrespectively.All mice were immunized three times at 2 weeks interval and were challenged each with 30±2 cercariae by abdominal skin penetration 4 weeks after the last booster.Six weeks of post-infection,mice were sacrificed by aether inhalation,and the numbers of worms and hepatic eggs were counted.Specific anti-pJCs levels in the mice sera collected one day before the second,third immunization and challenge infection were tested with ELISA.Mice immunized with pJCs given i.v.or s.c.exhibited high level of specific antibody and protection effects,but given i.v.was significantly higher than given s.c.in anti-pJCs level(P＜0.05)and showed significant reduction in worm burden(48.53%),liver eggs per gram(LEPG)load(54.54%),worm average weight(29.62%)and egg granuloma size(36.8%).The juvenile worm cells ofS.japonicumcould induce partial protective immunity againstS.japonicumin mice and the protective immunity by i.v.was better than that by s.c..These results indicated intravenous route was a feasible and efficacious route for juvenile worm cell immunization.

Schistosoma japonicum;primary juvenile worm cell;immune response;immunoprotection

R383.2

A

1002-2694(2010)07-0615-03

*國(guó)家自然科學(xué)基金(30570952)資助

余平,Email:yuping1953@sina.com

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系及細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,長(zhǎng)沙 410013;

2009-12-20;

2010-03-29