吉坤美,劉曉宇,唐 艷,詹政科,劉志剛

2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,深圳 518060;

3.深圳市人民醫(yī)院龍華分院,深圳 518109

標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗中主要變應(yīng)原Der f 2含量測(cè)定*

吉坤美1,劉曉宇2,唐 艷3,詹政科1,劉志剛1

目的研制粉塵螨Ⅱ組變應(yīng)原Derf 2單克隆抗體(Monoclonal Antibody,McAb),并建立雙單抗夾心ELISA檢測(cè)方法,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗中Der f 2的含量。方法應(yīng)用基因工程方法獲得粉塵螨變應(yīng)原Der f 2重組蛋白并通過(guò)親和層析純化,再免疫小鼠,利用間接ELISA篩選獲得McAb雜交瘤細(xì)胞株并純化、鑒定抗體的特異性;用一株單抗包被酶標(biāo)板,同時(shí)用生物素標(biāo)記另一株單抗,從而建立雙單抗體夾心ELISA法;并用此法測(cè)定粉塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗中Der f 2的含量。結(jié)果成功地獲得了一株單抗3B12與屋塵螨抗原具有交叉反應(yīng),另外一株單抗3G7與屋塵螨抗原沒(méi)有交叉反應(yīng),并建立了雙單抗夾心ELISA方法測(cè)定Der f 2的含量,其方法的檢測(cè)限為0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范圍內(nèi)線性良好;標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗中Der f 2的含量為100ng/10000BAU。結(jié)論成功制備了高效價(jià)抗Der f 2單抗,并建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。該方法具有很高的靈敏度,可以測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗中主要變應(yīng)原Der f 2含量,為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

塵螨過(guò)敏原;Der f 2;單克隆抗體;夾心ELISA

2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,深圳 518060;

3.深圳市人民醫(yī)院龍華分院,深圳 518109

塵螨是世界性分布的重要變應(yīng)原,室內(nèi)主要分布在臥具、沙發(fā)、地面以及空調(diào)濾網(wǎng)等處。引發(fā)人類過(guò)敏反應(yīng)的主要塵螨種類有屋塵螨(DermatophagoidesPteronyssinus,Der p)和粉塵螨(DermatophagoidesFarinae,Der f);其分泌物、排泄物及其尸體的降解物等以塵埃顆粒飛揚(yáng)于空氣中,過(guò)敏體質(zhì)者吸入后,可誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),從而引起哮喘、過(guò)敏性鼻炎、異位性皮炎和蕁麻疹等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病(又稱過(guò)敏性疾病)〔1-3〕。針對(duì)這類疾病,臨床上采用塵螨變應(yīng)原脫敏疫苗進(jìn)行治療是目前唯一對(duì)因治療方法〔4〕。為了保證疫苗的療效和用藥的安全性,WHO指出應(yīng)該采用標(biāo)準(zhǔn)化的塵螨變應(yīng)原制造脫敏疫苗〔4〕。

標(biāo)準(zhǔn)化塵螨變應(yīng)原必須保證其主要致敏成分含量可以測(cè)定且批次之間一致〔4-5〕。粉塵螨中最主要的致敏成分是Ⅰ組和Ⅱ組變應(yīng)原即Der f 1和Der f 2〔3〕。Der f 2前體由146個(gè)氨基酸組成,經(jīng)去除信號(hào)肽加工處理后為129個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為14 000,無(wú)糖基化位點(diǎn);70%～80%塵螨過(guò)敏患者血清 IgE結(jié)合Der f 2,并呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)〔6〕。國(guó)際上 Indoor Biotechnologies公司有針對(duì)塵螨第Ⅱ組變應(yīng)原含量測(cè)定的商品化試劑盒出售,但該試劑盒不能區(qū)分粉塵螨 Derf2和屋塵螨Derp2〔7〕;目前國(guó)內(nèi)尚無(wú) Der f 2的單克隆抗體制備以及研制含量測(cè)定ELISA試劑盒的報(bào)道。本研究用重組Der f 2做抗原制備單抗并建立了雙抗體夾心ELISA法,以快速檢測(cè)疫苗中Der f 2含量,為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的塵螨疫苗國(guó)產(chǎn)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4w齡BALB/c小鼠(SPF級(jí))購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 pET-Der f 2重組表達(dá)質(zhì)粒,E.coliBL21 star(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要試劑和儀器HiTrap protein G,硝酸纖維素膜(Amersham Pharmacia公司),福氏佐劑(BBI公司),吐溫 20、Anti-IgG-HRP 、鏈酶親和素-HRP、TMB(Sigma公司),NHS-Biotin(PIERCE公司),DEME干粉培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone公司),親和層析純化獲得的天然Der f 2標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)Indoor Biotechnologies公司),標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨疫苗10 000 BAU/mL(美國(guó) Allergy Laboratories藥廠),美國(guó)FDA惠贈(zèng)的粉塵螨疫苗標(biāo)準(zhǔn)品10 000 BAU/mL,粉塵螨和屋塵螨總蛋白由本室提供。垂直板型電泳槽(BIO-RAD),FPLC(Amersham Pharmacia公司),恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal force公司),洗板機(jī)(廣州豐華),酶標(biāo)儀(芬蘭 Thermo)。

1.2 方 法

1.2.1 重組Der f 2的表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性按照朱健琦等報(bào)道的方法〔8〕表達(dá)與純化Der f 2重組蛋白;經(jīng)Western blot分析證實(shí)該重組蛋白能與粉塵螨過(guò)敏患者血清的特異性IgE結(jié)合,具有免疫原性〔8〕。

1.2.2 抗粉塵螨Der f 2單克隆抗體的制備

1.2.2.1 重組蛋白免疫小鼠 首次免疫以Indoor公司純化的天然來(lái)源的Der f 2蛋白30μ g作為抗原和等量的福氏完全佐劑混合乳化后,皮下注射小鼠頸背部標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行免疫;加強(qiáng)免疫共2次,蛋白量同前,采用重組Der f 2蛋白,混入等量的福氏不完全佐劑。每次免疫間隔約3w。

1.2.2.2 細(xì)胞融合與篩選 取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞在PEG作用下融合。融合后的細(xì)胞置于HAT培養(yǎng)基中,鋪到96孔板中,在含5%CO2的培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)。融合7～8 d后,待雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至1/4孔大小時(shí),取上清液進(jìn)行篩選。采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液呈抗Der f 2抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。待克隆后的細(xì)胞生長(zhǎng)至1/4孔大小時(shí),進(jìn)行再篩選、克隆,直至出現(xiàn)所有孔細(xì)胞上清液均呈抗體Der f 2陽(yáng)性為止。

1.2.2.3 McAb小鼠腹水制備 在接種雜交瘤細(xì)胞1w前,向Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟。取雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù),離心后加入DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞懸浮,每只小鼠腹腔注射0.5 mL。1w后取腹水,離心取上清液,分裝,-20℃下長(zhǎng)期保存。

1.2.3 抗體的效價(jià)測(cè)定與純化 采用常規(guī)間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè),天然Der f 2標(biāo)準(zhǔn)品蛋白作為抗原按100ng/孔4℃包被過(guò)夜,封閉液為3%BSAPBST,37℃封閉2h,以獲取的腹水為一抗,同時(shí)用未免疫的BALB/c小鼠血清做平行陰性對(duì)照試驗(yàn),從1∶100開(kāi)始對(duì)倍梯度稀釋,37℃反應(yīng)1h,PBST洗3次后,加入羊抗鼠IgG-H RP作為二抗,37℃反應(yīng)1h,洗3次后加底物TMB顯色。測(cè)定孔O D值與陰性對(duì)照孔OD值之比大于2.1為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn),抗體的稀釋度即為抗體的效價(jià)?？贵w純化參照HiTrap protein G親和層析說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)抗Der f 2單克隆抗體的特異性 將天然來(lái)源的Der f 2標(biāo)準(zhǔn)品、重組Derf2蛋白、總Der f提取蛋白和總Der p提取蛋白以不同的濃度梯度包被微孔板,以抗Der f 2的單克隆抗體作為一抗,羊抗鼠IgG作為二抗,按照常規(guī)ELISA方法進(jìn)行特異性檢測(cè)分析;并同時(shí)進(jìn)行Western blot分析。

1.2.5 McAb的標(biāo)記 將純化好的抗體的原緩沖液替換成磷酸鹽緩沖溶液(PBS),然后將抗體與NHS活化的生物素(NSH-Biotin)按說(shuō)明書推薦的比例混合,避光反應(yīng)30min,用50kDa的超濾膜柱去除可能未參與標(biāo)記的NSH-Biotin。

1.2.6 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)Der f 2含量方法的建立 微孔板每孔加純化后的單抗 3G7 100ng,包被緩沖液為碳酸鹽,采用物理吸附法包被4℃過(guò)夜。倒掉包被液,用含0.5%的吐溫的 PBS洗滌液(PBST)洗一遍,每孔再加300μ L封閉液,37℃振蕩反應(yīng)2h,倒掉封閉液。粉塵螨抗原Der f 2標(biāo)準(zhǔn)品和基因工程重組的Der f 2分別按比例逐一稀釋,每孔加 100μ L,陰性對(duì)照孔用 PBS代替。37℃振蕩反應(yīng)1h,完后用PBST洗3次。生物素標(biāo)記的Der f 2單克隆抗體3B12按1∶1000的比例稀釋,每孔 100μ L加入,37℃振蕩反應(yīng) 1h,之后用PBST洗3次。然后將HRP-鏈酶親和素用分析緩沖液按1∶500的比例稀釋,每孔加 100μ L,37℃振蕩反應(yīng)1h,完后用 PBST洗3次。加底物A、B液,37℃顯色10min,加終止液后酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.2.7 雙抗夾心ELISA法用于標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨疫苗中Derf2含量的檢測(cè) 采ELISA法分別對(duì)美國(guó)Allergy Laboratories藥廠生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨疫苗10 000BAU/mL和美國(guó)FDA惠贈(zèng)的粉塵螨疫苗標(biāo)準(zhǔn)品10 000BAU/mL中Der f 2的含量進(jìn)行測(cè)定,3次求平均值,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組Der f 2的表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性 含重組Der f 2的陽(yáng)性克隆菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,獲高效表達(dá)。SDS-PAGE顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量15kDa左右處有外源蛋白表達(dá)的條帶出現(xiàn),目的蛋白表達(dá)時(shí)帶有6His-tag標(biāo)簽,表達(dá)蛋白分子量與理論預(yù)計(jì)值相符。純化后的重組Der f 2見(jiàn)圖1。

2.2 抗Der f 2單克隆抗體的制備與純化 為測(cè)定疫苗中的Der f 2的含量,得到識(shí)別Der f 2不同表位的單克隆抗體,從而建立雙抗體夾心的ELISA方法,我們通過(guò)一系列的克隆化,最終篩選到兩株不同的抗體,分別命名為3G7和3B12,并從小鼠中得到的腹水通過(guò)親和層析純化后,SDS-PAGE顯示,抗Der f 2單克隆 IgG抗體純度達(dá)到95%以上,見(jiàn)圖1。

2.3 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià) 間接ELISA測(cè)定鼠抗Der f 2單克隆抗體IgG效價(jià),結(jié)果如圖2,同時(shí)用未免疫的BALB/c小鼠血清做平行陰性對(duì)照試驗(yàn),隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加吸光值下降,以測(cè)定陽(yáng)性孔OD值與陰性對(duì)照孔OD值之比大于2.1為判斷標(biāo)準(zhǔn),測(cè)得3G7單克隆抗體腹水的效價(jià)約為1∶102 400,3B12單克隆抗體的腹水效價(jià)約為1∶204 800。這說(shuō)明本研究制備的抗體效價(jià)較高,可以被用來(lái)建立雙抗體夾心ELISA法。

2.4 抗Der f 2單克隆抗體的特異性分析 粉塵螨與屋塵螨主要過(guò)敏原成分Ⅱ組變應(yīng)原(Group II)Der f 2與Der p 2蛋白之間存在著高達(dá)80%的同源性,常常具有某些相交叉的抗原表位,所以針對(duì)它們的單克隆抗體有時(shí)難免會(huì)與兩個(gè)物種來(lái)源的過(guò)敏原成分存在交叉反應(yīng)〔7,9〕。為此,我們通過(guò)間接ELISA和Western blot兩種方法進(jìn)行了抗體特異性分析測(cè)定,結(jié)果顯示(見(jiàn)表1和圖3),單克隆抗體3B12與天然來(lái)源的Der f 2、重組蛋白Der f 2、Der f總蛋白(含有Der f 2)和Der p總蛋白(含Der p 2)均具有良好的反應(yīng)活性,這說(shuō)明單抗3B12與屋塵螨抗原具有交叉反應(yīng);但是另外一株單抗3G7僅與天然來(lái)源的Der f 2、重組蛋白Der f 2和Der f總蛋白(含有Der f 2)反應(yīng),不與屋塵螨總蛋白(含Der p 2)反應(yīng),說(shuō)明它與屋塵螨抗原沒(méi)有交叉反應(yīng)。這也反映這二株抗體識(shí)別的位點(diǎn)有所不同。

表1 間接ELISA測(cè)定單抗的特異性Table 1 Detection of specificity of monoclonal antibody against Der f 2 by indirect ELISA

圖3 抗Der f 2單克隆抗體的特異性分析1.天然來(lái)源的Der f 2;2.重組蛋白Der f 2;3.Der f總蛋白(含Der f 2);4.Der p總蛋白(含Der p 2);5、空白對(duì)照Fig.3 Detection of specificity of monoclonal antibody againstDer f 2 by Western blot 1.Native Der f 2;2.r Der f 2;3.Total proteins from Der f;4.Total proteins from Der p;5.Blank control

2.6 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)粉塵螨疫苗中Der f 2變應(yīng)原含量方法曲線 利用兩株不同的單抗(3G7,3B12)建立了雙抗夾心的ELISA法測(cè)定Der f 2的含量。通過(guò)測(cè)定天然來(lái)源的Der f 2含量建立標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線(見(jiàn)圖4),可見(jiàn)其檢測(cè)限為0.5ng/mL,在6.25ng/mL-300ng/mL范圍內(nèi)線性良好,其R2=0.9965。

圖4 雙單抗夾心ELISA測(cè)定Der f 2含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2:吸光度OD值與Derf2抗原濃度二者線性相關(guān)程度Fig.4 Standard curve of sandwich ELISA for determination of the concentration of native Der f 2

2.7 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)新制備粉塵螨變應(yīng)原疫苗 通過(guò)上述方法在同一塊ELISA板上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化粉塵螨疫苗 10 000BAU/mL(美國(guó)Allergy Laboratories藥廠)和美國(guó)FDA惠贈(zèng)的粉塵螨疫苗標(biāo)準(zhǔn)品10 000BAU/mL中Der f2含量,分別重復(fù)三次取平均值,結(jié)果美國(guó)Allergy Laboratories藥廠生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化疫苗中的Der f 2的含量為 100ng/10 000BAU,與美國(guó)FDA惠贈(zèng)的粉塵螨疫苗標(biāo)準(zhǔn)品中的Der f 2的含量為90ng/10 000BAU,二者比較接近。

3 討 論

過(guò)敏性疾病如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎等是臨床上常見(jiàn)病、多發(fā)病,被世界衛(wèi)生組織列為二十一世紀(jì)重點(diǎn)防治三大疾病之一,世界各國(guó)過(guò)敏性疾病總發(fā)病率高達(dá)10%～30%〔3,6〕。塵螨作為最主要的吸入性過(guò)敏原,嚴(yán)重地影響過(guò)敏患者的生活質(zhì)量。針對(duì)這類過(guò)敏性疾病的唯一對(duì)因治療通過(guò)注入不同劑量的塵螨過(guò)敏原疫苗對(duì)患者進(jìn)行脫敏治療〔4〕。我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)在臨床上均采用粉塵螨粗浸液對(duì)過(guò)敏患者進(jìn)行診斷和特異性免疫治療,而浸液組份復(fù)雜,容易降解及受外源性物質(zhì)污染,嚴(yán)重影響了治療的安全性和一致性,而且存在一定的潛在危險(xiǎn)性〔4-5〕。因此,迫切需要參照WHO的要求研制國(guó)產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化塵螨變應(yīng)脫敏疫苗。

標(biāo)準(zhǔn)化的粉塵螨變應(yīng)原必須保證其主要致敏成分Der f 1和Der f 2的含量可以測(cè)定且批次之間一致〔4,7〕。目前測(cè)定這類生化提取的、多種蛋白成分混合體系中某一組分含量的常用方法是雙單抗夾心ELISA法,這種方法如果條件優(yōu)化好可以獲得高度特異、高度靈敏的檢測(cè)效果。Jeong KY根據(jù)韓國(guó)粉塵螨物種來(lái)源的基因表達(dá)Der f 2蛋白并研制了雙單抗夾心ELISA,用來(lái)測(cè)定灰塵中Der f 2的含量;但未形成商品化試劑供應(yīng)〔10〕。Indoor Biotechnologies公司有針對(duì)塵螨第Ⅱ組變應(yīng)原含量測(cè)定的商品化試劑盒出售,但該試劑盒不能區(qū)分粉塵螨Der f 2和屋塵螨Der p 2〔7〕。為此,要實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的粉塵螨疫苗國(guó)產(chǎn)化必須研制基于雙單抗夾心法測(cè)定Der f 2的 ELISA試劑盒。通過(guò)雜交瘤融合技術(shù)獲得了二株能夠穩(wěn)定分泌抗Der f 2效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株,并對(duì)這些單抗的生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性進(jìn)行了分析,其中一株單抗3B12與屋塵螨抗原具有交叉反應(yīng),另外單抗一株3G7與屋塵螨抗原沒(méi)有交叉反應(yīng),這樣構(gòu)建的雙單抗ELISA可以很好地區(qū)分開(kāi)粉塵螨Der f 2和屋塵螨Der p 2,有利于粉塵螨疫苗研制過(guò)程中建立標(biāo)準(zhǔn)化的特異性檢測(cè)其主要致敏成分Der f 2含量的方法。

采用雙單抗夾心ELISA法測(cè)定提取變應(yīng)原的混合體系中某一特定成分含量的方法由于不是絕對(duì)含量的測(cè)定,而只是相對(duì)含量的測(cè)定〔7,10〕。首先,選用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡可能和要測(cè)定的樣品來(lái)源和性質(zhì)一致。如本研究測(cè)定的對(duì)象是粉塵螨提取的混合物中Der f 2含量,為此我們選用了Indoor Biotechnologies公司從粉塵螨中生化提取并經(jīng)親和層析純化的、具免疫學(xué)活性的天然Der f 2,這樣二者性質(zhì)相一致,而沒(méi)有采用基因工程重組的Der f 2做標(biāo)準(zhǔn)品,因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)包涵體來(lái)源的Der f 2雖然經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和純化,但其免疫學(xué)性質(zhì)很難和天然來(lái)源的Der f 2完全一致。其次,由于變應(yīng)原生物原材料、生化提取、測(cè)定方法等存在一定的批間差異,為此采用免疫學(xué)方法測(cè)定主要變應(yīng)原含量、變應(yīng)原總生物活性等指標(biāo)時(shí),與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照時(shí)會(huì)有一定的變化幅度,不可能完全一致。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2003年發(fā)布的《變態(tài)反應(yīng)原(變應(yīng)原)制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》就指出,“要求所測(cè)得的抗原效價(jià)在標(biāo)示效價(jià)的50%～200%之間,方法學(xué)研究應(yīng)證實(shí)效價(jià)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差小于等于20%”。本研究測(cè)定結(jié)果提示美國(guó)Allergy Laboratories藥廠生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化疫苗與美國(guó)FDA惠贈(zèng)的粉塵螨疫苗標(biāo)準(zhǔn)品中的Der f 2的含量二者比較接近,變化幅度在10%左右,符合變應(yīng)原標(biāo)準(zhǔn)化的要求。

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Immunoassay for the concentration of major allergen Der f 2 in standardDermatophagoides farinaevaccine products

JI Kun-mei1,LIU Xiao-yu2,TANG Yan3,ZHAN Zheng-ke1,LIU Zhi-gang1

(1.State Key Laboratory of Respiratory Disease for Allergy,Shengzhen University,Shenzhen518060,China;
2.School of Life Sciences,ShenzhenUniversity,Shenzhen518109,China;
3.Longhua Branch,Shenzhen People＇s Hospital,Shenzhen518109,China)

The designed monoclonal antibodies(McAb)against rDer f 2 and sandwich ELISA were performed to detect the concentration of major allergen Der f 2 inDermatophagoides farinaevaccine products.The rDer f 2 was expressed inE.coliand purified by affinity chromatograph.Balb/c mice were immunized with rDer f 2,and the indirect ELISA was used to screen the positive clones of hybridoma cell.With a McAb coated ELISA plate and a biotin labeled McAb,sandwich ELISA was performed to assay the concentration of major allergen Der f 2 in the vaccine products.Two monoclonal antibodies against Der f 2 were made and McAb 3G7 did not react with the extract fromDermatophagoides Pteronyssinus.In sandwich ELISA,the standard curve was linear and the rDer f 2 concentrations were from 6.25 ng/mL to 300 ng/mL with a low detection limit of about 0.5 ng/mL for rDer f 2.The concentration of major allergen Der f 2 in standardDermatophagoides farinaevaccine products was about 100ng per 10000BAU.In conclusion,the two McAbs against Der f 2 were made successfully and the sandwich ELISA kit could detect the concentration of major allergen Der f 2 in the vaccine products.

dust mite allergen;Der f 2;monoclonal antibody;sandwich ELISA

R384.4

A

1002-2694(2010)07-0663-05*國(guó)家“863”專題(No.2006AA02A231)和粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目(No.20054982207)聯(lián)合資助

劉志剛,Email:lzg@szu.edu.cn

1.呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室深圳大學(xué)變態(tài)反應(yīng)分室,深圳 518060;

2009-11-18;

2010-05-17