岳永亮,于彥杰,楊 瀟,程 梅,何 藹,曲振宇,劉 靜,王 琳,李卓雅,詹希美

廣州管圓線蟲組織蛋白酶Z基因的原核表達(dá)及免疫學(xué)分析*

岳永亮,于彥杰,楊 瀟,程 梅,何 藹,曲振宇,劉 靜,王 琳,李卓雅,詹希美

目的克隆并原核表達(dá)廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因,評價其融合蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用前景。方法利用生物信息學(xué)分析工具,分析廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能特征;克隆目的基因至原核表達(dá)載體pET30a(+),經(jīng)PCR、雙酶切鑒定后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE鑒定,融合蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化;ELISA檢測融合蛋白作為診斷抗原的敏感性及特異性。結(jié)果該蛋白理化性質(zhì)較穩(wěn)定,含有分泌型信號肽;含有構(gòu)成半胱氨酸蛋白酶催化中心的Cys84、His232和Asn253三個氨基酸殘基。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒且目的基因在E.coliBL21中獲得高效表達(dá),經(jīng)親和層析獲得了純化的融合蛋白。融合蛋白可被其免疫的BALB/c小鼠血清及感染廣州管圓線蟲的小鼠血清識別;作為包被抗原用于ELISA檢測小鼠血清其敏感性及特異性均為100%與粗抗原無差別,檢測其他寄生蟲病人血清及正常人血清其特異性分別為100%和97.4%與粗抗原相比特異性較高。結(jié)論廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z與多個物種組織蛋白酶-Z基因同源,是一種半胱氨酸蛋白酶,含有信號肽,可能是重要的蟲體分泌排泄抗原成分,在廣州管圓線蟲病的免疫診斷方面有潛在的應(yīng)用前景。

廣州管圓線蟲;組織蛋白酶-Z;生物信息學(xué);原核表達(dá);免疫診斷

廣州管圓線蟲在其適宜宿主大鼠體內(nèi)進(jìn)入肺動脈并發(fā)育為成蟲,而在人體及其他非適宜宿主體內(nèi)主要侵犯宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎為主要特征的廣州管圓線蟲病〔1〕。廣州管圓線蟲病患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀比較明顯,如劇烈的頭痛、頸項強(qiáng)直等腦膜刺激征,還有感覺過敏、肢體乏力,嚴(yán)重者可致昏迷甚至死亡〔2-3〕,然而廣州管圓線蟲病無特異的癥狀或體征,極易誤診、漏診從而造成嚴(yán)重后果。本實驗室從廣州管圓線蟲功能基因組學(xué)研究入手,開展了與致病、診斷和疫苗有關(guān)基因的鑒定和功能研究〔4〕。通過對構(gòu)建的四期幼蟲cDNA文庫大規(guī)模的測序及歸類,從中發(fā)現(xiàn)了組織蛋白酶-Z的同源基因。本研究通過生物信息學(xué)分析揭示該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征,預(yù)測編碼蛋白的生物學(xué)功能,克隆并通過原核表達(dá)該基因獲得了融合蛋白,ELISA法檢測了該融合蛋白用于診斷廣州管圓線蟲病的敏感性及特異性,為研制新型廣州管圓線蟲病診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級BALB/c雄性小鼠,由中山大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 文庫、質(zhì)粒、菌株 廣州管圓線蟲四期幼蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫由本室構(gòu)建,文庫的EST大規(guī)模測序和Unigene分析由上海聯(lián)合基因有限公司完成。原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)和E.coliBL21由本室保存。

1.1.3 主要試劑和工具酶 Taq DNA聚合酶,dNTP,K pnⅠ,X hoⅠ,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2 000)購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶(NEB)購自廣州基因公司。異丙硫代2β-D半乳糖苷(IPTG)購自美國 Promega公司;Ni-IDA Agarose購自美國Novagen公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自東盛生物公司;H RP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、DAB(3,3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;NC膜購自Millipore公司。First Strand cDNA Synthesis Kit購自美津生物試劑公司。

1.1.4 引物合成和DNA測序 基因擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。重組質(zhì)粒DNA測序由廣州瑞真生物技術(shù)有限公司完成。1.1.5 血清 陰性及陽性小鼠血清由本實驗室自制;其他寄生蟲病患者血清由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病原生物診斷中心提供;正常人類血清由本實驗室流行病調(diào)查收集血清。

1.2 方法

1.2.1 利用生物信息學(xué)軟件對所選基因與其它物種相似基因的同源性進(jìn)行預(yù)測 預(yù)測該基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)、功能特征。

1.2.2 實驗動物的感染與廣州管圓線蟲四期幼蟲的獲得 廣州管圓線蟲三期幼蟲40條左右灌胃法感染六周齡BALB/c雄性小鼠。感染后20d眼球取血制備陽性小鼠血清;解剖腦部獲得廣州管圓線蟲四期幼蟲。

1.2.3 組織蛋白酶-Z基因的擴(kuò)增Trizol法提取廣州管圓線蟲四期幼蟲的總 RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒,根據(jù)說明書進(jìn)行合成廣州管圓線蟲四期幼蟲的總cDNA第一鏈。根據(jù)已獲得的廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z cDNA序列,去除信號肽的編碼序列并設(shè)計引物。上游引物:ATGGTACCGCTAATAACAGATACAATCTCCG,帶KpnⅠ酶切位點;下游引物:ATCTCGAGT TACACAATCGGGTCCG,帶X hoⅠ酶切位點。以合成的廣州管圓線蟲四期幼蟲的總cDNA第一鏈為模板,使用合成的廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z特異引物擴(kuò)增目的基因。1%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。

1.2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)經(jīng)K pnⅠ,X hoⅠ,雙酶切后回收,連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR,雙酶切。

1.2.5 重組質(zhì)粒在E.coliBL21中的誘導(dǎo)表達(dá)取培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液,加入含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃250r/min振搖至OD450=0.4～0.6時,加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h。離心收集菌體,在沉淀中加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液,處理后離心1min,取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 融合蛋白的純化 經(jīng)摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)該蛋白為包涵體表達(dá),按優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體,冰上超聲裂解,離心收集沉淀,加入含尿素的結(jié)合緩沖液重懸沉淀,冰浴溶解包涵體,離心收集上清過濾,參照Ni-IDA Agarose說明書,進(jìn)行蛋白純化,收集蛋白洗脫液,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。透析去除尿素對蛋白的影響,蛋白濃縮后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實驗動物的免疫及血清IgG抗體滴度的測定 8周齡BALB/c小鼠20只隨機(jī)分為免疫組和對照組,每組10只。免疫組小鼠每只注射蛋白量約50μ g,與等體積弗氏完全佐劑混勻至乳化;間隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫,每只小鼠注射蛋白量與初次免疫劑量相同,與弗氏不完全佐劑混勻至乳化;間隔2周進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫,與第一次加強(qiáng)免疫相同;腹部四肢等多點皮內(nèi)注射免疫,每次免疫前斷尾取血,第3次免疫后2周,眼球取血,制備血清。對照組不進(jìn)行免疫,與免疫組小鼠同時取血,制備血清。ELISA法檢測實驗小鼠血清IgG抗體滴度水平。

1.2.8 Western blotting 將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,使用電轉(zhuǎn)移儀于100V冰浴轉(zhuǎn)印1h,將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。將含蛋白預(yù)染Marker條帶剪下觀察膜轉(zhuǎn)印效果。一抗分別為His標(biāo)簽單抗(1∶1 000稀釋)、免疫小鼠血清(1∶100稀釋)、廣州管圓線蟲感染陽性小鼠血清(1∶100稀釋),正常小鼠血清(1∶100稀釋),二抗為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)。DAB顯色至出現(xiàn)目的條帶,去離子水終止反應(yīng)。

1.2.9 兩種抗原診斷效果的比較 棋盤滴定法確定融合蛋白檢測小鼠血清最佳抗原包被濃度7μ g/mL,檢測人類血清最佳抗原包被濃度4μ g/mL;粗抗原檢測小鼠血清及人類血清最佳抗原包被濃度均為3μ g/mL;小鼠血清最佳稀釋度為1∶300;人類血清最佳稀釋度為1∶400;二抗最佳稀釋度為1∶30 000。融合蛋白與成蟲粗抗原分別用確定的最佳包被濃度包被96孔ELISA板,4℃包被過夜,一抗為待檢的小鼠血清、其他寄生蟲病患者血清及正常人類血清。二抗相應(yīng)的為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的兔抗人IgG。TMB顯色,2mol/L的H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測OD450值,比較兩種抗原的診斷效果。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析 克隆號為00012F09的EST基因在GenBank中與多個物種的組織蛋白酶-Z基因同源,其中與新隱桿線蟲的組織蛋白酶-Z的同源性最高,一致性達(dá)82%,相似性達(dá)89%。在物種進(jìn)化關(guān)系上,與新隱桿線蟲及秀麗隱桿線蟲源于同一祖先,親緣關(guān)系最近。編碼294個氨基酸;N端的17個氨基酸屬于分泌型信號肽,未發(fā)現(xiàn)線粒體等亞細(xì)胞定位序列,無跨膜序列;具有構(gòu)成真核生物半胱氨酸蛋白酶活性中心的3個氨基酸殘基(Asn253,Cys84,His232),片段屬于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白酶;蛋白的理論分子質(zhì)量約33.3kDa,在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖1中第1-2泳道是雙酶切鑒定結(jié)果,在750～1 000bp之間有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符。第3-4泳道PCR結(jié)果,出現(xiàn)與目的基因相符的條帶;質(zhì)粒PCR、雙酶切表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinants by PCR amplification and double digestion with restriction enzymes

2.3 蛋白表達(dá)純化結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL-21中表達(dá),SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖2-A大約在35kD左右處出現(xiàn)表達(dá)條帶,與目的蛋白分子量基本相符。將蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果如圖2-B,其位置與目的蛋白相符,證明目的蛋白純化成功。

圖2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL-21中的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product

2.3 Western blotting鑒定 His標(biāo)簽單抗、融合蛋白免疫的小鼠血清及感染廣州管圓線蟲的小鼠血清均與純化蛋白反應(yīng)顯示清晰的條帶。而正常的血清沒有出現(xiàn)反應(yīng)條帶,見圖3。

2.4 實驗小鼠IgG抗體水平的檢測 用棋盤滴定法確定的間接ELISA最佳條件,純化的融合蛋白作為包被抗原檢測實驗小鼠抗體水平,實驗小鼠免疫后血清IgG水平與對照組相比明顯升高,表明融合蛋白有很好的抗原性及免疫反應(yīng)性,見圖4。

2.5 純化融合蛋白與成蟲粗抗原診斷效果的評估分別用純化融合蛋白和粗抗原作為包被抗原檢測24份廣州管圓線蟲感染小鼠血清,20份陰性小鼠血清,根據(jù)陰性組的OD值計算臨界值(S+3D)。結(jié)果:融合蛋白臨界值 =0.442,粗抗原臨界值 =0.383,兩種抗原的敏感性均為 100%(24/24),特異性也為100%(20/20);檢測96份其他寄生蟲病人血清,根據(jù)11份陰性對照血清的OD值計算臨界值(S+3D),結(jié)果:融合蛋白臨界值=0.445,特異性為100%(96/96)粗抗原臨界值=0.419,特異性為93.7%(90/96);檢測 114份正常人血清,根據(jù) 11份陰性對照血清的OD值計算臨界值(S+3D),結(jié)果:融合蛋白臨界值=0.449,特異度為97.4%(111/114),粗抗原臨界值=0.465,特異度為 90.4%(103/114)。

通過統(tǒng)計學(xué)分析,檢測小鼠血清,采用融合蛋白抗原與粗抗原相比,融合蛋白與粗抗原的靈敏度與特異度均為100%,無區(qū)別;檢測其他寄生蟲感染病人血清融合蛋白的特異度高于粗抗原,P=0.029,小于0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義;檢測正常人血清采用融合蛋白的特異度比采用粗抗原的特異度高,且P=0.027,小于0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS軟件完成。

3 討 論

廣州管圓線蟲病的診斷,實驗室最常采用ELISA法檢測病人血清中的特異抗體。早期用于ELISA檢測的包被抗原通常為粗抗原,結(jié)果與其他寄生蟲有一定的交叉反應(yīng)〔5-6〕。近年相繼報道了用純化的特異性抗原來檢測病人血清和腦脊液中的抗體,在一定程度上降低了交叉反應(yīng)〔7-9〕。但大量獲得上述純化抗原均較困難,因此克隆表達(dá)廣州管圓線蟲具有高敏感性和特異性的抗原組分是廣州管圓線蟲病免疫診斷研究的重要方向。本實驗通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z含有信號肽,無線粒體等其他亞細(xì)胞靶向定位結(jié)構(gòu),無跨膜區(qū)域,因此推斷該蛋白酶為一種分泌性的蛋白酶,作為分泌抗原則有可能進(jìn)入宿主體內(nèi)刺激宿主產(chǎn)生可供臨床檢測的特異抗體;該蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶,有研究表明半胱氨酸蛋白酶是多種寄生蟲的免疫優(yōu)勢抗原,作為診斷抗原具有很好的敏感性及特異性〔10〕;與其它物種的組織蛋白酶-Z同源性較高,因此可能存在一定的交叉反應(yīng),這也可能是ELISA檢測值較高的原因之一。

本研究成功構(gòu)建了廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z的原核表達(dá)載體,并獲得了高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在,經(jīng)變性處理后親和層析純化能得到大量融合蛋白以供免疫動物或作為診斷抗原進(jìn)行ELISA檢測。使用該融合蛋白對免疫小鼠血清IgG抗體水平的檢測及Western blotting結(jié)果表明該蛋白酶具有很好的免疫原性和免疫反應(yīng)性;用于ELISA法檢測小鼠血清其敏感性及特異性與粗抗原無差別,對患其他寄生蟲病人類血清及正常人血清的檢測特異性高于粗抗原,因此該蛋白酶在廣州管圓線蟲病的免疫診斷方面有潛在的應(yīng)用價值。然而本實驗尚未能全面評價廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z在免疫診斷中的應(yīng)用價值,首先本實驗檢測的陽性小鼠其感染度均較高(感染度最低者腦部檢出24條四期廣州管圓線蟲),因此還需對不同感染度的血清進(jìn)行檢測,進(jìn)一步評價其敏感性;此外本實驗僅對血清IgG抗體進(jìn)行了檢測,有研究表明,廣州管圓線蟲感染小鼠或大鼠后其血清中特異性IgM抗體水平在感染后早期即開始升高,第6～8d可達(dá)高峰〔11-12〕。因此尚需對特異性IgM 抗體進(jìn)行檢測,進(jìn)一步評價融合蛋白在早期診斷中的價值。

〔1〕詹希美.人體寄生蟲學(xué)(八年制)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社2005:227-229.

〔2〕Sawanyawisuth K,T akahashi K,Hoshuyama T,et al.Clinical factors predictive of encephalitis caused byAngiostrongy lus cantonensis〔J〕 .Am J T rop Med Hyg,2009,81(4):698-701.

〔3〕李道寧,何藹,李旭東,等.廣州管圓線蟲病致3例嬰幼兒死亡報告〔J〕.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,21(12):42-43.

〔4〕He H,Cheng M,Yang X,et al.Preliminary molecular characterization of the human pathogenAngiostrongy lus cantonensis〔J〕.BMC Mol Biol,2009,10:97.

〔5〕Chye SM,Yen CM,Chen ER.Detection of circulating antigen by monoclonal antibodies for immunodiagnosis ofangiostrongy liasis〔J〕 .Am J T rop Med Hyg,1997,56(4):408.

〔6〕朱佩嫻,熊鐘謹(jǐn),吳春云,等.Dot-ELISA檢測廣州管圓線蟲抗體的研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2002,18(5):51-53.

〔7〕Maleewong W,Sombatsawat P,Intapan PM,et al.Immunoblot evaluation of the specificity of the 29-kDa antigen from young adult female wormsAngiostrongylus cantonensisfo r immunodiagnosis of human angiostrongyliasis〔J〕.Asian Pac J Allergy Immunol,2001,19(4):267-273.

〔8〕Chye SM,Chang JH,Yen CM.Immunodiagnosis of human eosinophilic meningitis using an antigen ofAngiostrongylus cantonensisL5with molecular weight 204 kD〔J〕.Acta Trop,2000,75(1):9-17.

〔9〕李華,陳曉光,沈浩賢,等.廣州管圓線蟲M r32000抗原的免疫診斷效果評價〔J〕.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,25(4):380-383.

〔10〕段文元,邱宗文.半胱氨酸蛋白酶在醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展〔J〕.中國血吸蟲病防治雜志,2004,16(3):231-235.

〔11〕陳代雄,沈浩賢,李小敏,等.廣州管圓線蟲感染大鼠血清 IgM抗體水平的動態(tài)觀察〔J〕.中國熱帶醫(yī)學(xué),2006,6(8):1356-1358.

〔12〕盧改會,申麗潔,何藹,等.IgM-ELISA法早期診斷廣州管圓線蟲感染的初步研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2009,25(1):56-58.

Prokaryotic expression of cathepsin Z gene fromAngiostrongylus cantonensisand the immunological analysis of the fusion protein

YUE Yong-liang,YU Yan-jie,YANG Xiao,CHENG Mei,HE Ai,QU Zhen-yu,LIU Jjin,WANG Lin,LI Zhuo-ya,ZHAN Xi-mei
(Department of Parasitology,ZhongshanSchool of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou510080,China)

In order to clone and express cathepsin Z gene ofAngiostrongyluscantonensis(A.cantonensis)to evaluate its prospects in immunodiagnosis,bioinformatics analysis tools were applied to analyze physicochemical properties,structural,and functional characteristics of gene encoded protein.Target gene was cloned into prokaryotic expression vector pET30a(+)and the recombinant was identified by PCR and double enzyme digestion respectively.When the recombinant was expressed inE.coliBL21 by IPTG induction,the expressed product was identified by SDS-PAGE and the fusion protein was purified by Ni-IDA affinity chromatography.As fusion protein was used as diagnostic antigen,the sensitivity and specificity of that were tested by ELISA.The protein contained a secretory signal peptide with stable physicochemical property and three key amino acids for cysteine proteinase,which contained Cys84,His232 and Asn253 to form the catalytic sites.The recombined plasmid was successfully constructed and expressed inE.coliBL21 effectively.Purified protein was obtained by affinity chromatography and could react with serum of mouse that infected withA.cantonensisor immunized with the fusion protein.ELISA results showed that the sensitivity and specificity were 100%in testing serum of mouse by using fusion protein as the coating antigen,and has no difference compared with crude antigen.But in the test for human serum,its specificity was higher than that of crude antigen.In conclusion,cathepsin Z ofA.cantonensisis homologous with cathepsin Z from other species and contained a secretory signal peptide.It is probably a crucial component of excretory-secretory antigen and might be a promising candidate for immunodiagnosis of Angiostrongyliasis.

Angiostrongyluscantonensis;Cathepsin-Z;bioinformatics;prokaryotic expression;immunodiagnosis

R383.1

A

1002-2694(2010)09-0810-04

*國家自然科學(xué)基金-廣東省人民政府聯(lián)合基金(u0632003);973項目(2010CB530004)基金資助

詹希美,Email:zhanximei@yahoo.com.cn

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室,廣州 510080

2010-01-19;

2010-06-20