李 楠,崔 晶,王書(shū)偉,李旭旭,王 莉,姜 鵬,藺西萌,王中全

2.河南省疾病預(yù)防控制中心,鄭州 450016

曼氏裂頭蚴感染小鼠血清IgG抗體動(dòng)態(tài)變化*

李 楠1,崔 晶1,王書(shū)偉1,李旭旭1,王 莉1,姜 鵬1,藺西萌2,王中全1

目的觀察小鼠實(shí)驗(yàn)感染曼氏裂頭蚴后不同時(shí)間血清IgG抗體水平的變化。方法40只小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只,1-5組小鼠采集尾靜脈血后分別經(jīng)口感染裂頭蚴1、2、4、6及8條。感染后1周開(kāi)始每周尾靜脈采血,分離血清,至感染后18周。應(yīng)用裂頭蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原ELISA檢測(cè)血清中抗裂頭蚴IgG抗體水平。結(jié)果2條裂頭蚴感染小鼠感染后2周的血清抗體陽(yáng)性率為87.5%(7/8),感染后3周升至100%(8/8);1、4、6及8條裂頭蚴感染小鼠感染后2周抗體陽(yáng)性率即達(dá)100%(8/8)。5組小鼠均是在感染2～4周后血清抗體水平快速升高,感染后5～7周達(dá)峰值,之后抗體水平稍有下降,至感染后第18周抗體陽(yáng)性率仍均為100%。5組小鼠感染裂頭蚴后1～18周血清抗體水平間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=245.296,P＜0.05),且抗體水平隨感染劑量的增加而升高。結(jié)論小鼠感染不同劑量裂頭蚴后2周即可檢出血清抗裂頭蚴抗體,ES抗原ELISA對(duì)不同感染度小鼠均有早期診斷價(jià)值。

裂頭蚴;裂頭蚴病;ELISA;排泄分泌抗原;小鼠

曼氏裂頭蚴病(sparganosis mansoni)是由曼氏迭宮絳蟲(chóng)(Spirometra mansoni)的幼蟲(chóng)-裂頭蚴(plerocercoid)寄生人體所致的人獸共患寄生蟲(chóng)病。本病呈世界性分布,但以東亞與東南亞國(guó)家多見(jiàn),我國(guó)已有1 000多例裂頭蚴病報(bào)道,分布于27個(gè)省、市、自治區(qū)〔1〕。裂頭蚴可經(jīng)口感染人體,也可經(jīng)皮膚傷口或口腔黏膜侵入人體,寄生于皮下、眼、口腔、腦及多個(gè)內(nèi)臟器官等。由于裂頭蚴的寄生部位廣泛,臨床表現(xiàn)多種多樣,皮膚裂頭蚴病的診斷主要依靠活檢,但多數(shù)腦部及內(nèi)臟裂頭蚴病只有1條裂頭蚴寄生〔2〕,手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大,病原學(xué)診斷較為困難,若不及時(shí)診斷和治療,可致患者殘疾甚至死亡。

目前,國(guó)內(nèi)外已有將裂頭蚴可溶性抗原通過(guò)ELISA用于裂頭蚴病的血清學(xué)診斷,但與其他寄生蟲(chóng)病(囊蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、并殖吸蟲(chóng)病、華支睪吸蟲(chóng)病及旋毛蟲(chóng)病等)均有明顯的交叉反應(yīng)〔3-5〕。此外,有人報(bào)告小鼠感染5條裂頭蚴后第4周血清抗裂頭蚴IgG水平才開(kāi)始快速升高〔6〕,裂頭蚴在人體寄生時(shí)間較長(zhǎng)者血清抗體陰性〔3〕。鑒于此,本文應(yīng)用裂頭蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原ELISA對(duì)裂頭蚴感染小鼠血清IgG抗體動(dòng)態(tài)進(jìn)行了觀察。

1 材料和方法

1.1 裂頭蚴與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 曼氏裂頭蚴采自河南省漯河地區(qū)自然感染的青蛙體內(nèi),選取伸縮活動(dòng)劇烈的裂頭蚴,用無(wú)菌生理鹽水清洗3次后經(jīng)口感染小鼠及用于抗原制備。健康雄性6周齡昆明小鼠,體重20g～25g,購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 裂頭蚴ES抗原的制備 參照旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ES抗原的制備方法〔7〕,將裂頭蚴用無(wú)菌生理鹽水清洗3次后置于無(wú)血清的1640培養(yǎng)液(含100U/mL青霉素及100U/mL鏈霉素)中,每個(gè)培養(yǎng)皿中加入20mL培養(yǎng)液與10條裂頭蚴。在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18h,培養(yǎng)過(guò)程中保證蟲(chóng)體完整無(wú)斷裂。將培養(yǎng)液于4℃2 000 g離心20 min,取上清裝入透析袋中,4℃用去離子水透析3 d。冷凍干燥濃縮至一定體積即為ES抗原?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)抗原蛋白含量為2.755mg/mL,分裝后置-80℃冰箱備用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)按常規(guī)間接ELISA法操作,用碳酸鹽緩沖液將ES抗原稀釋至2.5μ g/ml包被酶標(biāo)板,封閉液為含3%脫脂奶粉的PBST。待檢血清用封閉液1∶100稀釋,每份樣本加2孔,每孔100 μ L。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,工作濃度1∶10 000(北京中杉金橋生物制品公司)。底物為鄰苯二胺(OPD)。2mol/L H2SO4終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀(美國(guó)TECAN公司產(chǎn)品)測(cè)定吸光值(A492nm)。當(dāng)待測(cè)樣本兩孔A值的平均值≧陰性對(duì)照A值2.1倍時(shí)為陽(yáng)性。

1.4 裂頭蚴感染小鼠后血清樣本的采集 40只昆明小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只。1～5組小鼠每只分別經(jīng)口感染1、2、4、6、8 條裂頭蚴,感染前與感染后1～18周每周尾靜脈采血。所有實(shí)驗(yàn)小鼠于感染后第18周解剖,計(jì)數(shù)檢獲的裂頭蚴。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用方差分析與多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 感染小鼠血清抗體IgG動(dòng)態(tài) 各組小鼠感染裂頭蚴前后不同時(shí)間血清抗體IgG水平變化見(jiàn)圖1。感染前各組小鼠血清抗體IgG均為陰性。感染后第1周,第5組小鼠血清抗體陽(yáng)性率為37.5%(3/8),第1-4組小鼠血清抗體均為陰性;感染后第2周,第2組小鼠抗體陽(yáng)性率為87.5%(7/8),其各組小鼠抗體陽(yáng)性率均為100(8/8);感染后第3周,所有感染組小鼠陽(yáng)性率均為100%(8/8)。所有感染組小鼠均在感染后2～4周血清抗體快速升高,第5～7周達(dá)峰值。經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)各組小鼠感染后1～7周血清抗體水平間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ21=48.096,χ22=48.584,χ24=51.623,χ26=45.940,χ28=48.940,P均＜0.05);感染1條或2條裂頭蚴組小鼠的血清抗體水平在感染后7～18周無(wú)明顯降低(F1=0.513,F2=0.663,P＞0.05),感染 4、6、8 條裂頭蚴組小鼠在感染后7～18周的血清抗體水平有所降低(F4=6.590,F6=7.371,F8=5.555,P均＜0.05),但至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的感染后18周仍均為陽(yáng)性。

圖1 小鼠感染不同劑量曼氏裂頭蚴后的血清IgG抗體水平變化Fig.1 Anti-plerocercoid antibody dynamics in sera of mice infected with different dose of plerocercoids

2.2 感染蟲(chóng)數(shù)與血清抗體水平的關(guān)系 感染小鼠于感染后18周解剖,檢出的裂頭蚴數(shù)與感染數(shù)相等。經(jīng)方差分析,感染后1～18周,不同感染組小鼠之間的血清抗體水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=245.296,P＜0.05);進(jìn)一步兩兩比較,除第1組和第2組小鼠組間的抗體水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余3組小鼠間的抗體水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5組小鼠血清抗體水平與裂頭蚴感染劑量有相關(guān)性(r=0.323,P＜0.05),且小鼠感染裂頭蚴后的血清抗體水平均隨感染劑量的增加而升高。

3 討 論

Hong等〔6〕應(yīng)用裂頭蚴粗抗原ELISA檢測(cè)小鼠感染5條裂頭蚴后血清IgG抗體動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)感染后第4周抗體水平快速升高。本研究以裂頭蚴ES抗原ELISA檢測(cè)IgG抗體動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)感染1周后抗體即快速升高,至感染后第3周,所有感染組小鼠的抗體均為陽(yáng)性。提示裂頭蚴 ES抗原檢測(cè)IgG抗體,具有早期診斷價(jià)值,可能與裂頭蚴感染宿主后在體內(nèi)移行發(fā)育的過(guò)程中其ES抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)有關(guān),Chung等〔8〕應(yīng)用 immunoblot檢測(cè)裂頭蚴粗抗原,發(fā)現(xiàn)粗抗原中的36kDa～26kDa組分與感染后第2周小鼠血清IgG呈陽(yáng)性反應(yīng);27、31、36kDa蛋白是裂頭蚴ES抗原中的主要蛋白組分,且具有半胱氨酸酶活性〔9-10〕。上述結(jié)果表明,與裂頭蚴粗抗原相比,ES抗原具有更強(qiáng)的抗原性,其主要抗原分子能較早誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG,可用于裂頭蚴病的早期診斷。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),小鼠感染1條裂頭蚴后2周血清抗體陽(yáng)性率即達(dá)100%,血清抗體水平隨裂頭蚴感染條數(shù)的增加而升高。王越等〔5〕應(yīng)用裂頭蚴粗抗原ELISA檢測(cè)1～5條裂頭蚴感染小鼠7周后的血清抗體,發(fā)現(xiàn)1條裂頭蚴感染小鼠的血清抗體亦為陽(yáng)性,但不同劑量感染組小鼠之間的血清中抗體水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。裂頭蚴ES抗原檢測(cè)結(jié)果不同,提示小鼠血清抗裂頭蚴抗體水平與感染劑量呈正相關(guān)。裂頭蚴ES抗原ELISA不僅可用于裂頭蚴輕度感染的血清學(xué)診斷,而且還能根據(jù)抗體水平推測(cè)感染程度。

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Kinetics of specific IgG in sera of mice infected experimentally with plerocercoid ofSpirometra mansoni

LI Nan,CUI Jing,WANG Shu-wei,LI Xu-xu,WANG Li,JIANG Peng,LIN Xi-meng,WANG Zhong-quan
(Departmentof Parasitology,Medical College,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

To observe the changes of serum IgG levels in mice experimentally infected with plerocercoid ofSpirometra mansoni,40 male mice were randomly divided into 5 groups(8 mice per group)and each mouse inⅠtoⅤgroups was orally infected with 1,2,4,6 or 8 plerocercoids respectively after blood collection.Blood was collected weekly for 18 weeks post-infection(wpi)and the anti-plerocercoid antibodies IgG in serum were assayed by ELISA using excretory-secretory(ES)antigens ofSpirometramansoniplerocercoid.The serum antibodies positive rate of mice infected with 2 plerocercoids was 87.5%(7/8)at 2 wpi and increased to 100%(8/8)at 3 wpi.However,in other four groups of mice infected with 1,4,6 and 8 plerocercoids,the antibody positive rate was 100%(8/8)at 2 wpi.The serum anti-plerocercoid antibody levels in the 5 groups of infected mice increased rapidly at 2 to 4 wpi,and reached the peak during 5 to 7 wpi.Thereafter,the antibody level in the 5 groups decreased slightly,but the antibody positive rate was still 100%and lasted to 18 wpi as the experiment was finished.The difference of serum antibody levels during 1 to 18 wpi in the 5 groups was statistically significant(F=245.296,P＜0.05),and the serum antibody levels elevated along with the increase of infection dose.Results showed that serum anti-plerocercoid antibodies in mice infected with different doses of plerocercoid could be detected at 2 wpi,and ES antigens ELISA ofSpirometramansoniplerocercoid could be applied in the diagnosis of early sparganosis and light infection.

plerocercoid;sparganosis;ELISA;excretory-secretory(ES)antigens;mice

R383.3

A

1002-2694(2010)09-0837-03

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)(200903151,201003006)、河南省教育廳科技攻關(guān)(2010A310012)及鄭州大學(xué)研究生科學(xué)研究基金(D0403)資助項(xiàng)目

崔晶,Email:cuij@zzu.edu.cn

1.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室,鄭州 450052;

2.河南省疾病預(yù)防控制中心,鄭州 450016

2010-03-18;

2010-06-19