劉麗波，薛一雪，王萍

（中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

腦膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重影響人類健康的疾病，其預(yù)后差、生存期短，除手術(shù)治療外，化療是腦膠質(zhì)瘤治療的主要手段之一，但由于血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB）的存在限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響了化療療效［1］。為了將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤組織，選擇性地增加血腫瘤屏障的通透性是一個(gè)理想的策略，研究發(fā)現(xiàn)小劑量緩激肽（bradykinin，BK）可以選擇性開放血腫瘤屏障，卻不影響正常腦組織毛細(xì)血管的通透性［2］。藥物通過血腫瘤屏障到達(dá)腫瘤細(xì)胞主要有兩條途徑：增加吞飲小泡數(shù)量的跨細(xì)胞途徑和開放緊密連接的細(xì)胞旁途徑，研究證明緩激肽可同時(shí)通過上述兩條途徑選擇性開放血腫瘤屏障［3，4］。我們的前期研究進(jìn)一步證明BK可通過降低腫瘤微血管的緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、zonula occluden-1（ZO-1）和 claudin-5 的蛋白水平開放緊密連接［5］，但BK是否能夠影響緊密連接相關(guān)蛋白的mRNA水平及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 （cAMP response element binding protein，CREB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可能通過影響緊密連接相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性［6］。本研究旨在探討B(tài)K對緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，并分析可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步完善BK開放血腫瘤屏障緊密連接機(jī)制的闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：健康雌性Wistar大鼠112只，體質(zhì)量180～200 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑和器材：緩激肽、葡聚糖購于Sigma Chemical公司；TRIzol購于Invit rogen公司；RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司；兔抗大鼠CREB和兔抗大鼠p-CREB抗體購于Cell Signaling公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購于北京中杉公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma Scientific，美國）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司SW-CJ-1FD型）；立體定向儀（日本光電株式會社）；微量輸液泵（B.Braun Melsungen AG，德國）；臺式低溫超速離心機(jī)（3K18，德國）；分光光度計(jì)（Bausch＆Lomb，美國）；PCR 擴(kuò)增儀 （Biometra，GER）；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（Bio-Rad，美國）；轉(zhuǎn)印儀（DYY-Ⅲ 40B，北京市六一儀器廠）；-80℃超低溫冰箱（SANYO，日本）；恒溫冷凍切片機(jī)（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，BK 5 min組，BK 10 min組，BK 15 min組，BK 30 min組，BK 60 min組。每組16只大鼠。假手術(shù)組為未進(jìn)行腫瘤細(xì)胞移植的正常大鼠，模型組僅給予生理鹽水。

常規(guī)培養(yǎng)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用含有1.2%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基制備C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，濃度為1×105/μl備用。大鼠用10%水合氯醛（3.5 ml·kg-1）麻醉后，將其固定在腦立體定位儀上；將制備好的細(xì)胞懸液用微量注射器注入右側(cè)大腦基底核（前囟前1 mm，矢狀縫旁開3 mm，深4.5 mm）。腫瘤移植2周后用備用。

1.2.2 緩激肽灌注：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植2周后，用水合氯醛麻醉膠質(zhì)瘤大鼠，使其仰臥于操作臺上，進(jìn)行腹側(cè)頸部正中切口，分離右側(cè)的頸總和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，以10 μg·kg-1·min-1的速度從頸總動(dòng)脈的近端灌注BK。在操作的同時(shí)監(jiān)測大鼠的體溫和血壓。

1.2.3 RT-PCR法檢測occludin和ZO-1mRNA表達(dá)：采用15%葡聚糖梯度離心的方法提取正常腦組織和腫瘤組織的微血管段，應(yīng)用TRIzol提取微血管段的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。occludin引物：Sense 5′-GACCACTATGAAACCGAC TA-3′；Antisense 5′-CTCACTTCTCCAGCAACC-3′，擴(kuò)增長度為 411 bp；ZO-1引物：Sense 5′-TGCTATTAC ACGGTCCTC-3′；Antisense 5′-TGGTGCTCCTAAACAATC-3′，擴(kuò)增長度為 316 bp；β-actin引物：Sense 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；Antisense 5′-GCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3′，擴(kuò)增長度為 493 bp。以上引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃2 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用Bio-Rad凝膠成像儀成像，用Fluor Chen V 2.0 Stand Alone軟件對圖像進(jìn)行分析，結(jié)果以 occludin/β-actin、ZO-1/β-actin 的整合光密度值 （integrated density value，IDV）的比值表示。

1.2.4 Western blot檢測CREB和p-CREB的蛋白表達(dá)：提取正常腦組織和腫瘤組織微血管段，將各組微血管段置于裂解緩沖液中勻漿，離心，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合法進(jìn)行蛋白定量；等量蛋白（10～20 μg）經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉中4℃封閉過夜；分別用兔抗大鼠CREB多克隆抗體（1∶500稀釋）、兔抗大鼠p-CREB多克隆抗體（1∶800稀釋）和小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體（1∶1 000稀釋）與硝酸纖維素膜室溫孵育2 h；經(jīng)相應(yīng)二抗（1∶4 000稀釋）室溫孵育2 h后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法檢測免疫復(fù)合物的表達(dá)。采用Chemi Imager 5500 V2.03軟件對蛋白條帶進(jìn)行掃描，用Fluor Chen 2.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各條帶IDV，結(jié)果以CREB/β-actin和p-CREB/β-actin的IDV比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。組間比較用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測occludin和ZO-1mRNA的表達(dá)

在假手術(shù)組和模型組occludin和ZO-1mRNA有較高的表達(dá)，BK作用5 min后，腫瘤微血管中oc－cludin和ZO-1mRNA表達(dá)開始減少，最低值出現(xiàn)在BK作用15 min時(shí)，而后逐漸增加，在60 min時(shí)基本恢復(fù)到模型組水平（圖1）。與假手術(shù)組和模型組相比，BK 15 min組occludinmRNA的表達(dá)分別減少了24.56%和42.22%，ZO-1mRNA的表達(dá)分別減少了32.58%和44.49%（表1）。

表1 緩激肽對occludin與ZO-1mRNA表達(dá)和CREB與p-CREB蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.1 Effect of bradykinin on the mRNAexpression of occludin and ZO-1 and the protein expression of CREB and p-CREB（±s）

表1 緩激肽對occludin與ZO-1mRNA表達(dá)和CREB與p-CREB蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.1 Effect of bradykinin on the mRNAexpression of occludin and ZO-1 and the protein expression of CREB and p-CREB（±s）

1）P<0.05 vs sham operated group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.01 vs model group.

IDV by RT-PCR IDV by Western blot Occludin ZO-1 CREB p-CREB Sham operated 8 0.916±0.049 1.438±0.061 1.176±0.039 0.478±0.022 Model 8 1.136±0.0531） 1.746±0.0621） 1.197±0.039 0.485±0.027 5-min BK 8 0.911±0.0512） 1.469±0.0732） 0.913±0.0352） 0.721±0.0292）10-min BK 8 0.782±0.0433） 1.227±0.0693） 0.623±0.0313） 0.921±0.0313）15-min BK 8 0.691±0.0481），3） 0.969±0.0741），3） 0.534±0.0363） 1.093±0.0323）30-min BK 8 0.953±0.0522） 1.377±0.0742） 1.032±0.034 0.694±0.024 60-min BK 8 1.102±0.062 1.651±0.067 1.136±0.033 0.585±0.023 Group n

2.2 Western blot檢測CREB和p-CREB的表達(dá)

在假手術(shù)組和模型組CREB有較高的表達(dá)，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BK作用5 min后，腫瘤微血管中CREB的蛋白表達(dá)水平開始降低，在BK作用15 min時(shí)降低最明顯（P<0.01），而后逐漸增加，在60 min時(shí)基本恢復(fù)到模型組的水平。與CREB的表達(dá)趨勢相反，在假手術(shù)組和模型組p-CREB僅有少量表達(dá)，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BK作用5 min后，腫瘤微血管中p-CREB的蛋白表達(dá)水平開始升高，在BK作用15 min時(shí)達(dá)到峰值（P<0.01），而后逐漸減弱，在60 min時(shí)基本恢復(fù)到模型組的水平（圖2，表1）。

3 討論

血腦屏障由基膜、周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞終足和腦內(nèi)皮細(xì)胞組成，其中存在于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接在維持血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，它可以限制親水性物質(zhì)和大分子物質(zhì)在細(xì)胞旁的擴(kuò)散［7］。緊密連接主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白和細(xì)胞骨架蛋白組成，已經(jīng)確定的幾個(gè)組成緊密連接的跨膜蛋白包括occludin、claudins和黏附連接分子；胞質(zhì)附著蛋白 ZO-1、ZO-2、ZO-3 和 cingulin［8］。ZO-1是第一個(gè)被確定的緊密連接相關(guān)蛋白，它是連接跨膜蛋白（如occludin和claudin-5）和細(xì)胞骨架蛋白actin的橋梁［9］。occludin是第一個(gè)被確定的定位于緊密連接的完整膜蛋白［10］，經(jīng)過4次跨膜形成兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)，細(xì)胞外環(huán)與相鄰內(nèi)皮細(xì)胞的occludin細(xì)胞外環(huán)相互作用封閉細(xì)胞間縫隙［11］。盡管occludin在維持緊密連接完整性中的作用仍有爭議，但大多數(shù)研究者認(rèn)為occludin的缺失會引起緊密連接開放［7，12］。這些緊密連接相關(guān)蛋白彼此之間存在多重聯(lián)系，不僅維持緊密連接的完整性，而且為腦內(nèi)皮提供結(jié)構(gòu)支持，如果這些蛋白發(fā)生紊亂將會直接影響緊密連接的完整性，進(jìn)而改變血腦屏障的功能。本研究結(jié)果顯示BK降低了血腫瘤屏障微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1mRNA的表達(dá)，我們的前期研究已經(jīng)證明BK能夠降低occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平，說明BK能夠在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上調(diào)節(jié)occludin和ZO-1的表達(dá)。緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的減少可使其封閉細(xì)胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開放；ZO-1表達(dá)減少后則會引起occludin等跨膜蛋白從細(xì)胞骨架上解離，也可使occludin封閉細(xì)胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開放。這些結(jié)果說明BK能夠在不同水平上降低occludin和ZO-1的表達(dá)，通過細(xì)胞旁途徑開放血腫瘤屏障。

CREB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛而復(fù)雜的功能，在生理和病理?xiàng)l件下都發(fā)揮非常重要的作用［13］。CREB可被多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，磷酸化的CREB是其活性形式，研究顯示CREB激活后可引起內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白在DNA水平上發(fā)生改變，進(jìn)而引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞［6］，但CREB在BK調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄中的作用尚不清楚。研究顯示CREB參與了BK對人氣管平滑肌環(huán)氧化酶2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［14］，同時(shí)我們研究小組證明BK作用后能夠誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白的磷酸化［15］，因此推測BK可能通過激活CREB實(shí)現(xiàn)對腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)BK能夠引起腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞p-CREB蛋白表達(dá)的上調(diào)，降低CREB蛋白的表達(dá)，二者最明顯的變化均出現(xiàn)在BK作用15 min時(shí)，其變化時(shí)相與緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1mRNA的變化時(shí)相相對應(yīng)，提示BK可能通過CREB途徑調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)，進(jìn)而開放緊密連接，增加血腫瘤屏障的通透性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示BK能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子CREB可能參與了該過程。

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