謝晶 白軍 盛習(xí)鋒 曹建國(guó) 謝宛玉

1.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2. 湖南師范大學(xué)藥物工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410013

紫花牡荊素（Casticin）是一種從蔓荊子（Vitex trifolia L）中提取的具有廣泛藥理活性的多甲基黃酮化合物。有研究表明Casticin具有抗炎［1］、抗性激素［2］和抗腫瘤作用［3］。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道Casticin對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用，但其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用尚缺乏文獻(xiàn)資料。本研究檢測(cè)了Casticin 抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并進(jìn)一步選取細(xì)胞G2/M期運(yùn)行的關(guān)鍵蛋白P21和Cyclin B1為研究對(duì)象，探討Casticin誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞增殖的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Casticin由湖南師范大學(xué)藥物工程實(shí)驗(yàn)室提取、分離、純化獲得。人宮頸癌 HeLa細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。RPMI 1640（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青公司）；DMSO（Amresco公司）；MTT（Sigma公司）；多西他賽（Docetaxel，恒瑞醫(yī)藥有限公司）；兔抗P21單克隆抗體、兔抗Cyclin B1多克隆抗體（Beyotime公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色測(cè)定 細(xì)胞以每孔180 μL（含5×103個(gè)細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入20 μL含受試物（1、2、4 μg/mL Casticin）和對(duì)照藥品（0.1 μg/mL 多西他賽）的培養(yǎng)基。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL繼續(xù)培養(yǎng)6 h，吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，振蕩10 min使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀（ELX-800）以570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（A） 值［4］，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活性抑制率（IR）：IR=（1-A實(shí)驗(yàn)組均值/A空白對(duì)照組均值）×100%。按改良寇氏法求出IC50值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 平皿克隆法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔2×102個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)4～6 h待細(xì)胞貼壁后，分為6組（每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔）加入藥物，分別為：NS空白對(duì)照組，0.2%DMS溶媒對(duì)照組，0.1 μg/mL多西他賽陽(yáng)性藥物對(duì)照組，1、2、4 μg/mL Casticin實(shí)驗(yàn)組。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后終止培養(yǎng)，甲醇固定，Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)［5］，計(jì)算克隆形成抑制率：克隆形成抑制率（%）=（1-給藥組平均克隆數(shù)/NS對(duì)照組平均克隆數(shù)）×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 碘化丙啶染色FCM分析 取1%小牛血清同步化處理24 h的HeLa細(xì)胞，用含受試物和對(duì)照藥品的10%小牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用冰PBS洗2遍，用4 ℃70%的乙醇固定24 h后，碘化丙啶4 ℃避光染色［6］， 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 Western blot蛋白印跡檢測(cè) 用終濃度為1、2、4 μg/mL的Casticin 溶液分別處理HeLa細(xì)胞48 h后，用冰PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白［3］，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取30 μg樣品用 SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶-TBST室溫?fù)u床封閉2 h，一抗于37 ℃下溫育3 h，二抗于37 ℃下溫育1 h，ECL發(fā)光劑激發(fā)熒光，壓片顯影定影。結(jié)果用灰度掃描儀處理分析。

2 結(jié) 果

2.1 Casticin對(duì)人宮頸癌 HeLa細(xì)胞活性的影響 MTT比色測(cè)定的結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，在Casticin（1、2、4 μg/mL）在24、48、72 h時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞都有明顯的抑制作用（P＜0.05）；Casticin作用48 h時(shí)，不同藥物濃度組對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均為0.000）；多西他賽陽(yáng)性藥物對(duì)照組對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），與Casticin 4 μg/mL相接近，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043）；Casticin抑制HeLa細(xì)胞活性，呈時(shí)間和劑量依賴性，其中Casticin作用48 h的IC50值為2.82 μg/mL（圖1）。

2.2 Casticin對(duì)人宮頸癌 HeLa細(xì)胞集落形成的影響 Casticin經(jīng)1、2、4 μg/mL的作用7 d后，HeLa細(xì)胞克隆形成數(shù)逐漸減少，克隆形成率逐漸下降，HeLa細(xì)胞的集落抑制率分別為18.62%、43.16%和72.24%，明顯低于空白對(duì)照組（P均為0.000 ），表明Casticin對(duì)體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞克隆形成具有抑制作用，呈濃度依賴性；溶媒對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.397）；多西他賽陽(yáng)性藥物對(duì)照組對(duì)HeLa細(xì)胞克隆形成抑制率大于Casticin 4 μg/mL組，但兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056，表 1，圖2）。

圖1 不同濃度Casticin對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性抑制率Fig.1 Effect of Casticin with different concentrations for different time on proliferation of HeLa

表1 Casticin對(duì)HeLa細(xì)胞集落形成的影響Tab.1 Effect of Casticin with different concentrations on the colony formation of HeLa cells

2.3 Casticin對(duì)人宮頸癌 HeLa細(xì)胞周期的影響 PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，Casticin（1、2、4 μg/mL）處理HeLa細(xì)胞48 h，細(xì)胞明顯被阻滯于G2/M期。Casticin各處理組與空白對(duì)照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均為0.000）；Casticin各處理組之間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；多西他賽陽(yáng)性藥物對(duì)照組與空白對(duì)照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；多西他賽陽(yáng)性藥物對(duì)照組對(duì)HeLa細(xì)胞的G2/M期的阻滯率與Casticin 2 μg/mL組相近，兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056，表2，圖3)。

圖2 Casticin對(duì)HeLa細(xì)胞集落形成的影響Fig.2 The effect of Casticin on colony formation of HeLa cells

表2 Casticin作用HeLa細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effect of Casticin with different concentrations for 48 h on cell cycle of HeLa cells

圖3 Casticin作用HeLa細(xì)胞48 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of Casticin with different concentrations for 48 h on cell cycle of HeLa cells

2.4 Casticin對(duì)HeLa細(xì)胞P21和Cyclin B1蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)Casticin（1、2、4 μg/mL）處理 HeLa細(xì)胞48 h后，P21蛋白表達(dá)上調(diào)，呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pcontrolvs1 μg/mL Casticin=0.031、Pcontrol vs 2 μg/mL Casticin=0.000、Pcontrolvs4μg/mLCasticin=0.004）；Cyclin B1蛋白表達(dá)呈劑量依賴方式下調(diào)，Casticin 1 μg/mL與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.767），Casticin 2 μg/mL、 Casticin 4 μg/mL與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pcontrol vs 2 μg/mL Casticin=0.022、Pcontrol vs 4 μg/mL Casticin=0.000，圖4）。

3 討 論

Casticin是一種從蔓荊子中提取的具有廣泛藥理活性的多甲氧基黃酮類(lèi)化合物，是蔓荊子的主要成分，研究表明Casticin對(duì)正常細(xì)胞增殖無(wú)影響或影響較小，對(duì)人白血病、乳腺上皮癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、人結(jié)腸癌、人大腸癌、人肺癌、人纖維肉瘤、前列腺癌等癌細(xì)胞株的增殖具有抑制活性［3，6-7］。Kobayakawa等［7］報(bào)道Casticin對(duì)人表皮癌KB細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，認(rèn)為抑制微管蛋白的聚合作用而破壞有絲分裂紡錘體結(jié)構(gòu)，使其阻滯于G2/M期。Haidara等［6］通過(guò)研究Casticin對(duì)乳腺上皮癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)Casticin通過(guò)作用于多個(gè)靶標(biāo)分子來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞周期G2/M期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。G2/M與微管蛋白結(jié)合而干擾有絲分裂紡錘體結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致G2/M期阻滯。而微管蛋白的破壞會(huì)誘導(dǎo)P21的形成，從而抑制CDK1活性，阻滯細(xì)胞于G2/M期。同時(shí)Casticin對(duì)Cyclin A的直接下調(diào)作用參與了CDK1活性抑制，使Casticin不依賴P53而發(fā)揮抑制增殖活性。研究還發(fā)現(xiàn)Bcl-2的下調(diào)與凋亡前蛋白Bax上調(diào)相關(guān)，提高Bcl-2/Bax兩者的比例有利于促進(jìn)誘導(dǎo)凋亡作用。王海燕等［8］研究認(rèn)為Casticin抑制白血病k562細(xì)胞株增殖的機(jī)制為激活了線粒體調(diào)控的凋亡途徑，而Shen等［3］通過(guò)對(duì)K562細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用PI3K/AKT特異性抑制劑能夠增強(qiáng)Casticin的抗腫瘤效果。目前有關(guān)Casticin抑制細(xì)胞的增殖是獨(dú)立的過(guò)程還是細(xì)胞有絲分裂毀壞的結(jié)果的問(wèn)題仍未清楚。

本研究選取了人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)了Casticin對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用及其對(duì)細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)，并進(jìn)一步檢測(cè)其分子生物學(xué)機(jī)制。Cyclin B1是一種重要的周期蛋白，而細(xì)胞G2/M期的調(diào)節(jié)有賴于Cyclin B1/CDC2（CDK1的催化亞基）復(fù)合物的生成，復(fù)合物的形成增加可使細(xì)胞通過(guò)G2/M檢測(cè)點(diǎn)，從而引發(fā)細(xì)胞周期的運(yùn)行，因此Cyclin B1的增高與降低都會(huì)影響細(xì)胞周期的運(yùn)行［9-10］。本研究結(jié)果顯示：不同濃度Casticin作用于HeLa細(xì)胞后，Cyclin B1蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的升高而降低，說(shuō)明細(xì)胞的增殖抑制可能與下調(diào)Cyclin B1表達(dá)，影響Cyclin B1/CDC2復(fù)合物的生成，以及負(fù)調(diào)節(jié)G2/M期運(yùn)行有關(guān)，這與Kobayakawa等［7］和Haidara等［6］的報(bào)道結(jié)果相似。

圖4 Western Blot檢測(cè)Casticin作用HeLa細(xì)胞48 h后蛋白表達(dá)變化Fig.4 The expression of proteins of HeLa cells treated with Casticin for 48 h (analyzed by Western blot)

P21是周期蛋白CDK1抑制物［11-12］，它有兩個(gè)獨(dú)特的功能區(qū)，其中N-端部分的殘基的功能是介導(dǎo)CDK1的阻斷效應(yīng)，抑制周期蛋白CDK1活性的表達(dá)，從而減少Cyclin B1-CDK1復(fù)合物的生成及其活性，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而使細(xì)胞阻滯于G2/M期［13］，從而影響細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的Casticin作用于HeLa細(xì)胞后增殖受到抑制，P21蛋白表達(dá)上調(diào)，與Shen等［3］和Haidara等［6］報(bào)道的Casticin作用于K562細(xì)胞后，P21蛋白表達(dá)上調(diào)結(jié)果相似。

綜上所述，Casticin抑制HeLa細(xì)胞增殖可能是通過(guò)活化P21蛋白表達(dá)，降低Cyclin B1蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）的影響在微克每毫升水平，其作用明顯弱于臨床常用生物堿類(lèi)化療藥物多西他賽，但是Casticin是從傳統(tǒng)中藥蔓荊子中提取的多甲基黃酮類(lèi)化合物，對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)生長(zhǎng)抑制作用，而對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，其對(duì)細(xì)胞的選擇性強(qiáng)于多西他賽［6-7］。本研究通過(guò)對(duì)Casticin抑制HeLa細(xì)胞增殖效應(yīng)以及分子生物學(xué)機(jī)制的探討，提示它可能是治療宮頸癌等惡性腫瘤的有效化療藥物，具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，但目前的研究還僅限于體外實(shí)驗(yàn)，其在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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