陳佳艷 綜述 樊旼 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射治療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其中80%～85%的病例為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐洲，每年肺癌新發(fā)病例超過20萬，因其死亡的人數(shù)占所有癌癥相關(guān)死亡的20%。在美國，每年約有15萬患者死于肺癌［1-3］。在中國大陸，肺癌的發(fā)病率和病死率均呈顯著升高的趨勢。據(jù)2008年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，肺癌相關(guān)死亡率居惡性腫瘤總死亡率的首位，為30.83/10萬。在男女惡性腫瘤相關(guān)死亡中，肺癌均為最主要原因［4］。

手術(shù)、放療和化療一直都是NSCLC的主要治療方法。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，人們越來越多的把焦點(diǎn)聚向了以特異性高、不良反應(yīng)輕為特點(diǎn)的分子靶向治療。近幾年來，在肺癌的分子靶向治療領(lǐng)域，研究熱點(diǎn)一直集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶點(diǎn)上，涌現(xiàn)出許多針對這些靶點(diǎn)的分子靶向藥物。臨床實(shí)踐證明并非所有患者都能從中獲益，NSCLC各組織類型間存在分子靶向藥物療效上的差異。例如多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)腺癌為EGFR-TKI的優(yōu)勢人群。然而即便同樣身為腺癌患者，使用EGFR-TKI后有些可以獲得疾病的長期緩解，有些會(huì)在TKI初始有效后出現(xiàn)獲得性耐藥，還有一些患者則原發(fā)性耐藥。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在原有突變基礎(chǔ)上，EGFR 20號外顯子上C-T堿基置換后導(dǎo)致的T790M的錯(cuò)義突變，MET癌基因的擴(kuò)增與EGFR-TKI獲得性耐藥有關(guān)［5］，K-ras基因突變則是產(chǎn)生原發(fā)耐藥的相關(guān)機(jī)制之一［6］。近期發(fā)現(xiàn)的EML4-ALK融合基因，其與EGFR突變，K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有該基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點(diǎn)是肺腺癌特異性較高的分子標(biāo)記物，并且很有可能是繼T790M、K-ras之后EGFR-TKI耐藥的又一重要機(jī)制，因此備受關(guān)注。

1 EML4-ALK基因的發(fā)現(xiàn)

2007年Soda等［7］在1例62歲的吸煙肺腺癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本中，擴(kuò)增出一個(gè)由3 926 bp組成的DNA片段，可以編碼一個(gè)由1 059個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白的氨基端（殘基1-496）是人類EML4編碼蛋白（基因庫編號NM-019063）的一部分，而羧基端（殘基497-1059）則由人類ALK（基因庫編號 AB209477）編碼蛋白的一部分構(gòu)成，研究人員從中得到啟發(fā)，編碼這一蛋白的基因很有可能是EML4和ALK融合基因。

EML4屬于棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族，由N末端堿基區(qū)，疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）以及WD重復(fù)區(qū)3部分構(gòu)成。在EML4-ALK融合基因中，與ALK的胞內(nèi)近胞膜部分發(fā)生融合的是EML4的部分N末端堿基、HELP和部分WD重復(fù)區(qū)［8-10］。

ALK于1994年首先發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤AMS3細(xì)胞株中［11］，是由1 620個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族［12］。該蛋白由膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域組成，下游信號通路為Ras-ERK，JAK3-STAT3，以及PI3-K/Akt等，這些通路與細(xì)胞增殖、存活、遷移密切相關(guān)［13-14］。

2 EML4-ALK基因的體外轉(zhuǎn)化致瘤活性

EML4-ALK融合基因的重排發(fā)生在2號染色體短臂上的2區(qū)1帶和2區(qū)3帶。Soda等［7］通過測序得出，EML4的13號外顯子上斷裂產(chǎn)生的3.6 kb大小的片段插入并連接上ALK的20號外顯子的一個(gè)297 bp大小的片段，共同構(gòu)成了融合基因（1型）。在這一研究的基礎(chǔ)上，2008年研究人員把轉(zhuǎn)染了融合基因的小鼠3T3成纖維細(xì)胞接種在裸鼠身上，建立了表達(dá)EML4-ALK融合基因的肺癌的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型（小鼠），發(fā)現(xiàn)在小鼠肺部腫瘤發(fā)生的全過程中，EML4-ALK基因均發(fā)揮著重要作用，進(jìn)一步在體外證實(shí)了該融合基因的轉(zhuǎn)化致瘤活性。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)EML4 N末端的堿基區(qū)域?qū)τ谄渲铝龌钚宰顬殛P(guān)鍵，可能與其在EML4-ALK基因聚合過程中發(fā)揮重要作用有關(guān)［15］。

3 EML4-ALK基因與NSCLC

Soda等［7］在隨后的研究中，應(yīng)用RT-PCR的方法對于75例NSCLC患者的組織標(biāo)本進(jìn)行了EML4-ALK融合基因、EGFR18、19、20號外顯子突變，以及K-ras突變的檢測，發(fā)現(xiàn)5例患者存在EML4-ALK 1型融合基因（3例腺癌，2例鱗癌），同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因陽性的患者與EGFR以及K-ras突變陽性的患者沒有重疊。并且，在繼續(xù)檢測了261例包括非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、胃腸道腫瘤在內(nèi)的其他惡性腫瘤的EML4-ALK融合基因后，均未發(fā)現(xiàn)含有該基因。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)了EML4在20號外顯子附近斷裂后與ALK進(jìn)行融合的第2種亞型（2型）。最終，研究者得出結(jié)論，該融合基因很有可能是NSCLC特有的一個(gè)新型基因靶點(diǎn)。在檢測方法上，RT-PCR是一種較為敏感的方法，可以在很少DNA拷貝數(shù)的情況下，甚至是在只有極少數(shù)EML4-ALK陽性細(xì)胞的痰液中，檢測出融合基因的存在。

同年，Inamura等［16］使用RT-PCR的方法檢測221例包含了腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌以及小細(xì)胞癌在內(nèi)的肺癌患者EML4-ALK融合基因的mRNA情況，對于檢測陽性的患者，進(jìn)一步使用免疫組化的方法觀察融合基因的表達(dá)。結(jié)果只在腺癌這一組織類型中檢測到5例患者（3.4%）有融合基因的mRNA并均在細(xì)胞質(zhì)中用免疫組化檢測到ALK融合蛋白。

上述2項(xiàng)研究均來自日本，隨后在1項(xiàng)來自歐美的多中心參與的研究中，Perner等［17］使用FISH方法檢測600例NSCLC患者EML4-ALK基因情況，發(fā)現(xiàn)融合基因的發(fā)生率小于Soda報(bào)道的6.7%以及Kentaro 報(bào)道的3.4%，只有2.7%。并且在檢測出融合基因的腫瘤中，并不是所有的腫瘤細(xì)胞均含有該融合基因。發(fā)生率的差異，可能與人種不同有關(guān)。研究人員因?yàn)閮H僅在1例患者中證實(shí)融合基因?yàn)榛蛑嘏艑?dǎo)致，由此認(rèn)為就其機(jī)制而言，存在著比Soda等報(bào)道的簡單插入更為復(fù)雜的，導(dǎo)致EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的基因水平的改變。

由于早先研究淋巴瘤ALK融合基因類型的過程中，發(fā)現(xiàn)除了人們熟知的NPM-ALK之外還有10多種其他的融合方式，與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。那么在NSCLC中，是否也存在除了EML4-ALK融合基因以外的其他類型的ALK融合基因，也有學(xué)者就此展開研究。Rikova等［18］的實(shí)驗(yàn)中，研究了41種NSCLC細(xì)胞株以及150例NSCLC腫瘤標(biāo)本中磷酸化的酪氨酸相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)，ALK相關(guān)融合基因除了3例為EML4-ALK外，還有1例為TFG-ALK融合基因。但在2008年Shinmura等［19］的研究中，使用RT-PCR以及測序檢測的77例NSCLC患者，除了2例腺癌患者檢測到EML4-ALK（2.6%，1型融合體和2型融合體各1例）外，并沒有發(fā)現(xiàn)含有NPM、TPM3、CLTC、ATIC和TFG-ALK的其他ALK相關(guān)的融合基因。

隨著研究的深入，研究人員還發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK融合基因的其他亞型，區(qū)別主要在于EML4發(fā)生截?cái)嗟奈稽c(diǎn)不同。Choi等［20］報(bào)道了EML4的6號外顯子附近與ALK 20號外顯子銜接的亞型3。Takeuchi等［21］發(fā)現(xiàn)的EML4的14號外顯子和2號外顯子與ALK 20號外顯子結(jié)合的亞型4和亞型5以及后來發(fā)現(xiàn)的亞型6和亞型7［22］。

就EML4-ALK是否為NSCLC唯一特有的靶點(diǎn)這一問題，F(xiàn)ukuyoshi等［23］分別檢測了104例肺癌、555例胃腸道腫瘤、90例乳腺癌標(biāo)本，僅1例肺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK的轉(zhuǎn)錄，在其余的腫瘤中均未發(fā)現(xiàn)該融合基因，研究者認(rèn)為這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈提示這一靶點(diǎn)很有可能為NSCLC所特有。但是緊接著2009年Lin等［24］發(fā)表在 Mol Cancer Res上的研究中，209例乳癌患者5例檢出該融合基因，83例結(jié)直腸癌患者2例檢出，106例NSCLC中有12例檢出，提示該融合基因也可能與包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤相關(guān)，但仍以NSCLC中檢出率最高。

4 EML4-ALK陽性患者的臨床特征

有趣的是，隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不斷積累，和最初Soda等［7］得出的結(jié)果相一致，EML4-ALK融合基因確實(shí)極少與常見于NSCLC的EGFR突變以及K-ras突變并存于同一組織標(biāo)本。一組來自日本的數(shù)據(jù)中，Inamura等［25］檢測了363例肺癌組織樣本，11例腺癌中檢出融合基因，對于這11例標(biāo)本，進(jìn)一步研究其與EGFR、K-ras、TP53突變以及TTF-1的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)EML4-ALK陽性的腫瘤具有下列特征：腺泡來源，分化更差，極少伴有EGFR以及K-ras的突變，偶爾伴有TP53突變，多發(fā)生于不吸煙或輕度吸煙患者，經(jīng)常伴有TTF-1表達(dá)。香港大學(xué)的Wong等［26］對266例手術(shù)切除的原發(fā)性肺癌患者的標(biāo)本進(jìn)行了檢測，13例患者（4.9%）標(biāo)本中檢出了融合基因，腺癌11例，腺鱗癌2例；同樣地，他們發(fā)現(xiàn)融合基因更易發(fā)生于不吸煙、年輕以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合以上數(shù)據(jù)，2009年Shaw等［27］進(jìn)行了更為細(xì)致的研究，他們以女性、亞裔、輕度或者不吸煙的腺癌中至少符合2項(xiàng)為標(biāo)準(zhǔn)，有選擇性地挑選了141例NSCLC，檢測了標(biāo)本中的EML4-ALK、EGFR以及K-ras突變情況，共檢出了19例（13%）EML4-ALK，其中18例為腺癌，1例為腺鱗癌。發(fā)生上述3種突變的患者沒有重疊。與EGFR突變組以及EGFR、ALK突變均陰性的野生組相比，EML4-ALK陽性的患者更年輕，多為男性，輕度或者不吸煙。在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，該融合基因與EGFR TKI的抗拒性有關(guān)。

那么中國人群NSCLC患者中該融合基因的情況究竟如何。2009年Zhang等［28］使用RACEPCR為基礎(chǔ)的測序法共檢測了109例NSCLC標(biāo)本，檢出12例陽性（11.01%），除外1、2、3、5亞型外，在3例腺癌患者中檢出了EML4 18號外顯子的亞型。所有EML4-ALK陽性患者均無K-ras突變，但是與以往研究不同的是，在1例女性腺癌中出現(xiàn)EML4-ALK與EGFR19號外顯子突變的并存。是否在中國NSCLC患者中有不一樣的情況，還需要進(jìn)一步研究。關(guān)于EML4-ALK基因在NSCLC中檢出情況見表1。

表1 EML4-ALK在NSCLC中檢出情況Tab.1 Studies evaluating EML4-ALK positivity in NSCLC

5 針對EML4/ALK基因的抑制劑

任何一個(gè)腫瘤新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，最后都著眼于設(shè)計(jì)出安全有效的藥物，在分子水平治療上腫瘤。1項(xiàng)歐美與韓國共同參與的多中心研究初步評價(jià)了針對EML4-ALK這一新型靶點(diǎn)的抑制劑。Koivunen等［29］使用RT-PCR以及外顯子序列分析的方法分析了305例NSCLC患者（美國138例，韓國167例）組織以及83個(gè)NSCLC細(xì)胞株，8例（3%）患者腫瘤中以及3個(gè)細(xì)胞株中（3.6%）檢出融合基因。在1例NSCLC細(xì)胞株體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，針對ALK的抑制劑TAE684體現(xiàn)了抑制ALK激酶活性、增加腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。另外一種口服的AKT抑制劑（PF02341066）目前正在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中接受安全性和有效性的評估［30］。

綜上所述，EML4-ALK是NSCLC發(fā)生發(fā)展中獨(dú)立而又關(guān)鍵的分子靶點(diǎn)，主要發(fā)生于腺癌，EGFR、K-ras野生型，輕度吸煙/不吸煙，年輕男性患者?？赡苁荰790M、K-ras和MET之外另一潛在的EGFR-TKI耐藥機(jī)制之一。針對這一靶點(diǎn)的深入研究，將有助于篩選EGFRTKI合適的治療人群并開創(chuàng)EGFR-TKI耐藥的NSCLC靶向治療新領(lǐng)域。

［1］ Borras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions (1955-1997)［J］. Ann Oncol,2003, 14(1): 159-161.

［2］ Tyczynski JE, Bray F, Parkin DM. Lung cancer in Europe in 2000: epidemiology, prevention, and early detection［J］.Lancet Oncol, 2003, 4(1): 45-55.

［3］ Jemal A, Murray T, Samuels A, et al. Cancer statistics, 2003［J］. CA Cancer J Clin, 2003, 53(1): 5-26.

［4］ 中華人民共和國衛(wèi)生部. 《2008年中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)》年鑒［M］. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2008: 214-215.

［5］ Bean J, Brennan C, Shih J, et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib［J］. P Natl Acad Sci USA, 2007, 104(52): 20932-20937.

［6］ Han SW, Kim TY, Jeon YK, et al. Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and Akt phosphorylation［J］.Clin Cancer Res, 2006, 12(8): 2538-2544.

［7］ Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small cell lung cancer［J］. Nature, 2007, 448(7153): 561-566.

［8］ Pollmann M, Parwaresch R, Adam-Klages S, et al. Human EML4, a novel member of the EMAP family, is essential for microtubule formation［J］. Exp Cell Res, 2006, 312(17):3241-3251.

［9］ Eichenmuller B, Everley P, Palange J, et al. The human EMAP-like protein-70(ELP70) is a microtubule destabilizer that localizes to the mitotic apparatus［J］. J Biol Chem,2002, 277(2): 1301-1309.

［10］ Smith TF, Gaitatzes C, Saxena K, et al. The WD repeat: a common architecture for diverse functions［J］. Trends Biochem Sci, 1999, 24(5): 181-185.

［11］ Shiota M, Fujimoto J, Semba T, et al. Hyperphosphorylation of a novel 80 kDa protein-tyrosine kinase similar to Ltk in a human Ki-1 lymphoma cell line, AMS3［J］. Oncogene,1994, 9(6): 1567-1574.

［12］ Morris SW, Naeve C, Mathew P, et al. ALK, the chromosome 2 gene locus altered by the t(2;5) in non-Hodgkin's lymphoma,encodes a novel neural receptor tyrosine kinase that is highly related to leukocyte tyrosine kinase (LTK)［J］. Oncology,1997, 14(18): 2175-2188.

［13］ Chiarle R, Voena C, Ambrogio C, et al. The anaplastic lymphoma kinase in the pathogenesis of cancer［J］. Nat Rev Cancer, 2008, 8(1): 11-23.

［14］ Gleason BC, Hornick JL. Inflammatory myofibroblastic tumours: where are we now?［J］. J Clin Pathol, 2008, 61(4):428-437.

［15］ Soda, M, Takada S, Takeuchi K, et al. A mouse model for EML4-ALK-positive lung cancer［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(50): 19893-19897.

［16］ Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers［J］. J Thorac Oncol, 2008, 3(1): 13-17.

［17］ Perner S, Wagner P L, Demichelis F, et al. EML4-ALK fusion lung cancer: a rare acquired event［J］. Neoplasia, 2008,10(3): 298-302.

［18］ Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer［J］. Cell, 2007, 131(6): 1190-1203.

［19］ Shinmura K, Kageyama S, Tao H, et al. EML4-ALK fusion transcripts, but no NPM-, TPM3-, CLTC-, ATIC-, or TFGALK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas［J］. Lung Cancer, 2008, 61(2): 163-169.

［20］ Choi YL, Takeuchi K, Soda M, et al. Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lung cancer［J］. Cancer Res, 2008, 68(13): 4971-4976.

［21］ Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts［J］. Clin Cancer Res, 2008, 14(20): 6618-6624.

［22］ Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer［J］.Clin Cancer Res, 2009, 15(9): 3143-3149.

［23］ Fukuyoshi Y, Inoue H, Kita Y, et al. EML4-ALK fusion transcript is not found in gastrointestinal and breast cancers［J］. Br J Cancer, 2008, 98(9): 1536-1539.

［24］ Lin E, Li L, Guan Y, et al. Exon array profiling detects EML4-ALK fusion in breast, colorectal, and non-small cell lung cancers［J］. Mol Cancer Res, 2009, 7(9): 1466-1476.

［25］ Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK lung cancers are characterized by rare other mutations, a TTF-1 cell lineage, an acinar histology, and young onset［J］. Mod Pathol, 2009, 22(4): 508-515.

［26］ Wong DW, Leung EL, Kam-Ting K, et al. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and K-ras［J］. Cancer, 2009, 115(8): 1723-1733.

［27］ Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small cell lung cancer who harbor EML4-ALK［J］. J Clin Oncol, 2009, 27(26): 4247-4253.

［28］ Zhang XC, Zhang S, Yang XN, et al. Multiple EML4-ALK fusion transcripts and concurrent EGFR kinase mutation in Chinese non-small cell lung cancer［J］. J Thorac Oncol,2009, 4(9): S549.

［29］ Koivunen JP, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer［J］. Clin Cancer Res, 2008, 14(13): 4275-4283.

［30］ Kwak EL, Camidge DR, Clark J, et al. Clinical activity observed in a phase Ⅰ dose escalation trial of an oral c-met and ALK inhibitor,PF-02341066［J］. J Clin Oncol, 2009,27: 15s (abstr).