呂濟(jì)相 王濟(jì)明 羅詩樵 黃國(guó)飛

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶 400016

膽管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在我國(guó)的消化道惡性腫瘤中居第5位，占各種惡性腫瘤死亡的0.48%，每年約有4 500人死于膽道惡性腫瘤。該病起病隱匿，臨床癥狀及體征出現(xiàn)晚，早期診斷困難、預(yù)后差，因此尋找能特異性早期診斷膽管癌的方法是目前臨床上迫切需要解決的問題［1］。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)［2］對(duì)膽管癌組織和膽管正常膽管黏膜組織進(jìn)行對(duì)比分析，找出存在的差異蛋白，為篩選可用于臨床早期診斷膽管癌的特異性生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本 本實(shí)驗(yàn)中用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的組織標(biāo)本全部來自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，取2007—2009年間的16個(gè)病例，其中男性、女性各8例，年齡35～76歲，平均年齡55.5歲，中位年齡57歲。術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。所有病例切除的標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為膽管腺癌，其中高分化4例，中分化4例，低分化8例。正常膽管組織來源于肝移植患者供肝修肝丟棄的部分。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集后均立刻放入液氮罐中凍存。

1.2 主要試劑 固相pH梯度干膠條（IPG）（pH：3～10，17 cm）（Bio-Rad公司）、IPG緩沖液（pH：3～10）、 尿素、硫脲、3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（3-［（3-Cholanidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate，CHAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、三羥甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane， Tris-base］、碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA）、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、硝酸銀、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘油、瓊脂糖、胰蛋白酶、鐵氰化鉀和2DE-Cleanup試劑盒GE（均 Amersham 公司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、四甲基二乙胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、乙腈、三氟乙酸（Sigma公司）、牛血清白蛋白（bovine serium albumin，BSA）（上海生工），其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要軟件 PDQuest8.0 2-DE圖像分析軟件（Bio-rad公司）、凝膠掃描儀Scanmaker 4685（Bechman公司）、MALDI-TOF-MS Voyager DE-PRO（美國(guó)ABI公司）等。

1.4 樣品制備 在液氮條件下將組織研磨成粉末，加入細(xì)胞裂解液（尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，體積分?jǐn)?shù)0.002的Bio-lyte兩性電解質(zhì)），加入DNA、RNA酶各5μL，4 ℃冰箱靜置30 min，然后4 ℃ 16 000 r/min、離心1 h，取少量上清液用Bradford法定量，其余上清液分裝并且放在-80℃冰箱凍存。

1.5 固相pH梯度雙向凝膠電泳 ⑴第一向固相pH梯度等電聚焦：主要按Gorg等［3］的方法和Protean IEF cell等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行；⑵第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：將平衡后的膠條移至1.0 mm厚的120 g/L的SDS-PAGE膠上至溴酚藍(lán)條帶遷移至距底邊1～2 cm處；⑶銀染：參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行硝酸銀染色。

1.6 凝膠圖像分析 在相同條件下對(duì)每例患者的膽管癌組織和正常組織的總蛋白樣品分別進(jìn)行了3次雙向凝膠電泳，銀染顯色的凝膠通過GS-800凝膠掃描儀獲取圖像，用PDQuest軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配和獲取斑點(diǎn)位置坐標(biāo)等。統(tǒng)計(jì)分析使用t檢驗(yàn)法。選取蛋白斑點(diǎn)表達(dá)差異大于2倍、t檢驗(yàn)P＜0.05的斑點(diǎn)作為研究蛋白。

1.7 制備質(zhì)譜樣品 蛋白質(zhì)點(diǎn)從銀染凝膠中切取成1～2 mm2大小的膠塊，經(jīng)水洗、脫色、脫水、酶解和萃取后送質(zhì)譜分析。

1.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析 將質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，參數(shù)設(shè)置為：種屬Homo sapiens；肽段容忍度75×10-6；離子碎片容忍度0.2；蛋白質(zhì)檢索得分大于95的認(rèn)為是成功鑒定的蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 凝膠圖譜分析結(jié)果 膽管癌組織和正常組織總蛋白分布模式非常相似（圖1），其識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為（1 087±40）和（1 048±11），凝膠中斑點(diǎn)的平均匹配率分別為84.0和80.3。第一向等電聚焦（IEF）的平均偏差為（1.16±0.29）mm，第二向SDS-PAGE方向上的斑點(diǎn)位置偏差為（1.00±0.38） mm。

PDQuest軟件分析顯示，有70個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅存在于癌組織中（圖1A），有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅出現(xiàn)在正常組織中（圖1B）；癌組織與正常黏膜組織相比，有19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)且大于5倍，正常組織與癌組織相比，上調(diào)相差5倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)有41個(gè)。

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果 在膽管癌組織和膽管正常黏膜組織的2-DE圖譜中，選取膽管組織癌中高表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)18個(gè)，進(jìn)行MALDITOF-MS分析，得到蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖（PMF），18個(gè)點(diǎn)共獲取18張PMF。圖2為銜接蛋白成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體底物2蛋白的肽質(zhì)量指紋圖。我們根據(jù)從數(shù)據(jù)庫查到的蛋白點(diǎn)的組織來源性，以及與膽管癌分化和生長(zhǎng)的相關(guān)性大小列出了6個(gè)意義相對(duì)較大的差異蛋白點(diǎn)（表1）。

圖1 膽管癌組織(A)和膽管正常組織（B）的2-DE圖譜Fig.1 Two-dimensional protein maps of cholangiocarcinoma (A) and matched normal tissue (B)

圖2 銜接蛋白成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體底物2蛋白的肽質(zhì)量指紋圖（PMF）Fig.2 The peptide mass fingerprinting of fibroblast growth factor recptor substrate 2

表1 膽管癌組織與正常組織差異蛋白點(diǎn)的鑒定結(jié)果Tab.l Characteristics of identified proteins expressed in cholangiocarcinoma and matched normal tissue

3 討 論

盡管近年來對(duì)早期發(fā)現(xiàn)膽管癌從生理、生化和分子生物學(xué)等進(jìn)行了許多研究，如對(duì)膽汁中的癌胚抗原（CEA）、糖類抗原等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)膽汁中以及腫瘤標(biāo)本的癌基因和抑癌基因等研究也取得了一些進(jìn)展，如目前實(shí)驗(yàn)室用于膽管癌檢測(cè)的癌抗原19-9（CA19-9）的敏感度為67.5%，特異度達(dá)到86.8%［5］。但總體來說，能用于臨床、同時(shí)具有高敏感性及高特異性的早期診斷膽管癌和提高其預(yù)后的標(biāo)志物尚未發(fā)現(xiàn)。目前用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一是雙向凝膠電泳技術(shù)，我們通過反復(fù)摸索，建立了分辨率高、重復(fù)性好的雙向凝膠電泳方法系統(tǒng)，這保證了我們進(jìn)行腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析的基本條件。

本實(shí)驗(yàn)我們鑒定出了一些差異蛋白質(zhì)，其中匹配分?jǐn)?shù)大于63分的差異蛋白點(diǎn)共有18個(gè)，并篩選出6個(gè)意義相對(duì)較大的差異蛋白點(diǎn)。

連環(huán)蛋白是一組具有相似結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)糖蛋白家族，它們的氨基酸組成中都具有數(shù)個(gè)相同序列的結(jié)構(gòu)域。目前將該家族分為四大類：α、?、γ和p120ctn，其中?-連環(huán)蛋白（?catenin）尤為重要。?-catenin的氨基端有130個(gè)氨基酸，富含Ser、Thr位點(diǎn)，控制著分子的穩(wěn)定性；羧基端由100個(gè)氨基酸組成，負(fù)責(zé)激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。?-catenin最重要的結(jié)構(gòu)是含有12個(gè)armadillo重復(fù)區(qū)，它們形成一個(gè)棒狀的超螺旋結(jié)構(gòu)，可防止蛋白水解，在與E-鈣黏蛋白（E-cad）、活化蛋白C（APC）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TCF）等的結(jié)合過程中有重要作用［6］。?-catenin基因突變后，胞質(zhì)內(nèi)游離?-catenin積聚，發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與轉(zhuǎn)錄因子Tclf4結(jié)合，啟動(dòng)c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-7、CD44等靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，這些靶基因在細(xì)胞增殖和癌變過程中起著重要作用［7］。鄭啟昌等［8］研究發(fā)現(xiàn)在肝門部膽管癌細(xì)胞中?-catenin存在異常表達(dá)，并與c-myc陽性表達(dá)呈顯著的正相關(guān)，且?-catenin異常表達(dá)與肝門部膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這可能是因?yàn)榘┘?xì)胞膜上的?-catenin向胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致 E-cad/cat復(fù)合體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，使防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的屏障消失，從而致使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular response kinase，ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要途徑。近期研究表明，ERK蛋白表達(dá)與某些惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。據(jù)王江寧［9］報(bào)道p-ERK1/2蛋白在高、中、低分化膽管癌組織中的表達(dá)組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其表達(dá)與腫瘤的病理分化程度密切相關(guān)，分化越差P-ERK1/2蛋白表達(dá)越高。但與年齡、性別、臨床TNM分期無關(guān)。此外，p-ERK1/2蛋白陽性表達(dá)的患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。因此，P-ERK1/2的表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，并對(duì)判斷膽管癌預(yù)后有一定價(jià)值。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究腫瘤相關(guān)蛋白提供了有效手段，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，鑒定出與膽管相關(guān)的蛋白18個(gè)。某些蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞分化相關(guān)［10］。對(duì)其功能的深入研究，有可能為膽管癌的診斷、治療提供新的靶向性分子標(biāo)志物，以達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)、有效治療的目的，改善總體預(yù)后。

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