羅小軍 孔憲炳 閻雄 周江山

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶 400016

在哺乳動物中，Hedgehog（HH）信號通路主要由HH配體（Sonic hedgehog，Shh；Indian hedgehog，Ihh；Desert hedgehog，Dhh），2個跨膜蛋白受體Ptch和Smo，核轉錄因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）組成。HH信號通路在胚胎時期對組織分化及發(fā)育調節(jié)起了巨大作用，最近越來越多的研究顯示，其激活能導致多種腫瘤形成，如基底細胞癌、髓母細胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道腫瘤等［1-3］，但Sonic Hedgehog（SHH）信號通路在肝癌中的作用國內報道尚不多。本研究旨在通過免疫組織化學和RTPCR法檢測SHH信號通路中Shh、Gli2在人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞系和組織中的表達，研究Shh和Gli2表達與HCC臨床病理之間的關系，探討Shh和Gli2在HCC中的表達及其臨床意義，為肝癌的防治研究尋求新的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2007年2月—2008年8月期間重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收治的肝癌及肝內膽管結石手術切除患者的標本。所有患者均經病理確診，肝癌30例，另外收集肝硬化患者標本20例，正常肝組織標本10例。30例肝癌標本中，男性23例，女性7例；年齡36～73歲，平均年齡52.7歲；腫瘤直徑平均5.9 cm（2.1～13.0 cm），根據Edmondson分級標準分級：Ⅰ～Ⅱ 級17例，Ⅲ～Ⅳ級13例；伴有肝內門靜脈侵犯12 例，無肝內門靜脈侵犯18 例；肝癌伴有肝硬化17 例，肝癌無肝硬化13 例；肝癌伴乙肝陽性26 例，肝癌無乙肝陽性4 例；肝癌伴血清甲胎蛋白升高（＞25 ng/mL）22例，肝癌血清甲胎蛋白正常（≤25 ng/mL）8例。收集10例新鮮肝癌組織及癌旁肝組織標本（距離肝癌腫塊5 cm以上），手術后立刻置液氮凍存。所有標本都經組織病理學確診。人肝細胞肝癌細胞系HepG2、Huh7由重慶醫(yī)科大學病理生理實驗室惠贈。

1.2 試劑 兔抗人Shh、Gli2多克隆抗體購自武漢中美科技有限公司，兔抗人Smo多克隆抗體購自Abcam公司。SP試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。RNA提取試劑TRIzol購自天根生化科技公司，RT試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測 組織標本經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)制備切片。采用免疫組織化學SP法檢測Shh和Gli2的表達，檢測方法按試劑盒操作說明，切片常規(guī)脫蠟至水，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑37 ℃條件處理10 min，微波抗原修復；山羊血清封閉后，滴加一抗（Shh為1∶150稀釋，Gli2為1∶100稀釋，Smo為1∶50稀釋）4 ℃過夜；生物素標記的山羊抗兔IgG 37 ℃反應30 min后，辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素37 ℃反應15 min，DAB顯色，蘇木精對比復染，脫水，透明，封固。

免疫組織化學檢測結果判定標準：普通光學顯微鏡下每張切片隨機選取5個高倍鏡視野觀察細胞，細胞質和（或）細胞核出現棕黃或棕褐顆粒為陽性細胞，根據陽性細胞染色強度以及陽性細胞在總細胞中所占比例判定實驗結果。根據染色程度的不同評分：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分；兩者積分的乘積作為染色結果的評判標準：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），＞4分為陽性（++～+++）。

1.3.2 RT-PCR法檢測 Shh和Gli2 mRNA的表達 肝癌組織在液氮冷凍條件下，將標本組織研磨成粉末，趁液氮尚未完全揮發(fā)，每100 mg組織加1.0 mL TRIzol裂解液，吹打均勻，充分裂解后把液體轉移到1.5 mL EP管中，加0.2 mL氯仿抽提RNA，再加等體積異丙醇沉淀RNA，最后用DEPC處理水充分溶解RNA。提取的總RNA經紫外分光光度計測定濃度，A260/A280比值在1.8～2.0，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

人肝癌細胞株HepG2、Huh7培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗時選用對數生長期細胞（細胞數量5×106個），TRIzol法提取總RNA，按TaKaRa公司兩步法試劑盒說明書進行RT-PCR檢測。引物由上海生物工程有限公司設計合成，引物序列、產物大小如表1所示。PCR擴增體系25 μL，反應條件為：Shh 94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；最后再72 ℃延伸 5 min；Gli2 94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。RT-PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，數字成像系統拍照分析。

表1 Shh基因引物序列及產物大小Tab.1 Primers and fragment sizes of SHH signaling genes

1.4 統計處理 所有數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，數據以表示，采用Fisher精確檢驗和單因素方差分析檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學檢測SHH信號通路表達的結果 30例HCC標本中，Shh、Gli2蛋白染色陽性率分別是63.3%（19/30）和66.7%（20/30）。Shh蛋白主要在細胞質中表達，呈棕褐色顆粒；Gli2蛋白在細胞核和細胞質中都有表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒。檢測結果顯示，正常肝組織中無SHH信號通路蛋白Shh、Gli2的表達。在部分肝硬化組織中也檢測到了SHH信號通路蛋白Shh、Smo蛋白的表達（圖1）。

2.2 SHH信號通路蛋白的表達與HCC臨床病理的關系 由表2可見Gli2蛋白表達與HCC肝內門靜脈侵犯及腫瘤病理分級相關，差異有統計學意義（P＜0.05），在伴有肝門靜脈侵犯和腫瘤組織低分化的HCC中Gli2蛋白高表達。Gli2蛋白表達與腫瘤大小、是否合并肝硬化及HBV感染無明顯相關性。Shh蛋白表達與HCC各臨床病理特征均無明顯相關性。血清腫瘤標記物甲胎蛋白在臨床中常用作為肝癌患者診斷和復發(fā)的重要指標，經檢測顯示血清甲胎蛋白與HCC中SHH通路蛋白Shh、Gli2的表達無明顯相關（P＞0.05）。

2.3 RT-PCR檢測肝癌組織和細胞系中SHH信號通路表達的結果 Shh、Gli2 mRNA在HCC組織表達率分別為60%（6/10）和70%（7/10），與免疫組織化學檢測結果相一致。癌旁組織中Shh和Gli2 mRNA表達率為20%（2/10）、30%（3/10），Shh和Gli2 mRNA在HCC組織表達高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。HepG2、Huh7細胞系均有Shh和Gli2 mRNA的表達。SHH信號通路在Huh7中表達高于HepG2，但兩者間差異無統計學意義（P>0.05，圖2，表3）。

圖2 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細胞系中的表達Fig.2 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines

表2 SHH信號通路蛋白的表達與HCC臨床病理的關系Tab.2 Relationship between expression of SHH signaling protein and clinical features of HCC(n)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細胞系中的表達Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細胞系中的表達Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

*: Compared with adjacent-tumor tissues group; △: Compared with Huh7 group.

3 討 論

在哺乳動物中，HH信號通路主要由Hedgehog配體（Shh、Ihh和Dhh）、2個跨膜蛋白受體Ptch和Smo、核轉錄因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）組成。當HH信號通路激活時，HH配體與Ptch結合，解除了Ptch對Smo的抑制效應，Smo進入細胞質激活下游轉錄因子Gli，誘導目的基因表達，進而調控細胞生長、增殖和分化。

原發(fā)性肝細胞肝癌的形成是多步驟、多階段的過程，可能由多種基因參與，涉及多條信號通路，但發(fā)病機制目前仍不清楚。Sicklick等［4］在HCC中檢測到SHH信號通路基因Shh、Ptch、Smo和Gli1高表達，說明HCC中存在SHH信號通路的表達。本研究結果發(fā)現Shh、Gli2蛋白在HCC組織中大量表達，而在正常人肝組織中無陽性發(fā)現，提示參與肝臟早期的胚胎發(fā)育及組織分化的SHH信號通路在肝癌中大量激活，可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展［5-6］，而成熟的正常肝組織中無SHH信號通路表達［7］。SHH信號通路在肝癌細胞系HepG2、Huh7中存在表達，且在Huh7中表達高于HepG2，這種差異可能是由于SHH信號通路在不同肝癌細胞系中激活不同所致。

本研究在部分肝硬化組織中檢測到SHH信號通路的表達，說明SHH信號通路不僅在肝癌中表達，而且SHH信號通路在肝硬化中也有激活。這與先前研究的在原發(fā)性膽汁性肝硬化病變和其他肝硬化組織中存在SHH信號通路的異常激活一致［4,8］。Huang等［9］在部分肝癌癌旁組織中檢測到SHH信號通路表達，發(fā)現這些癌旁組織存在細胞分化不良甚至有微小癌灶，而其他分化良好的癌旁組織中則無SHH信號通路表達。由此說明，SHH信號通路的激活可能發(fā)生在HCC的早期階段。

本研究進一步分析了SHH信號通路基因的表達與HCC腫瘤相關病理特征之間的關系。結果顯示Gli2的表達在伴有肝門靜脈侵犯和低分化的HCC組中明顯高于在無肝門靜脈侵犯和高分化的HCC組，提示Gli2的表達可能與肝癌的惡性程度相關。近來Kim等［10］采用反義寡核苷酸方法在肝癌中通過抑制Gli2基因的表達可以下調c-Myc、Bcl2和上調p27的表達，從而抑制肝癌細胞的生長，說明針對SHH信號通路的特異性靶向治療將可能成為肝癌治療的一條新途徑。

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