李建國 柳曉義 王宇 胡建霞 曹明智

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺外科，山東 青島，266003

甲狀腺非髓樣癌（non-medullary thyroid cancer，NMTC）起源于甲狀腺上皮細胞，約占所有甲狀腺癌的90%。主要包括乳頭狀癌和濾泡狀癌，未分化癌和Hurthle細胞癌較少見。20%～25%的甲狀腺髓樣癌病例是家族性的，而NMTC家族遺傳因素很少。

甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg） 和促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）基因在非惡性甲狀腺疾病中的作用已有報道，研究發(fā)現(xiàn)Tg基因的改變與甲狀腺腫相關(guān)［1-4］，甲狀腺腫在NMTC家系中出現(xiàn)頻率較高，且是NMTC的已知危險因素［5］。Tg基因中A7589G序列改變是Q2511R多態(tài)性的基礎(chǔ)［6］。TSHR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，結(jié)合促甲狀腺激素后發(fā)揮促進濾泡細胞生長和分泌激素的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)TSHR基因多態(tài)性改變與甲狀腺增生和甲狀腺腫瘤有關(guān)［7-8］。本研究通過對中國北方漢族人群Tg或TSHR基因多態(tài)性進行檢測，來探討甲狀腺非髓樣癌的易感基因。

1 資料和方法

1.1 資料 2004年6月—2008年6月期間，本院共收集NMTC住院患者176例（設(shè)為NMTC組），其中男性82例，女性94例，平均年齡（50.7±5.64）歲，所有患者均經(jīng)病理診斷證實為NMTC。具體分為乳頭狀、濾泡狀、Hurtle細胞或混合乳頭狀和濾泡狀細胞癌。同時設(shè)置對照組184例，其中男性84例，女性100例，平均年齡（49.5±4.65）歲，均為在本院健康查體中心體檢并經(jīng)篩選的健康人群。

1.2 方法

1.2.1 外周血采集 NMTC組患者均抽取空腹外周血5 mL（術(shù)前、未化療），對照組同樣抽取空腹外周血5 mL，置于預(yù)先加入1 mL ACD抗凝劑的圓底離心管中，顛倒混勻，編號記錄后放入-80 ℃低溫冰箱中保存，3個月內(nèi)提取DNA。

1.2.2 TSHR C253A多態(tài)性檢測 ⑴基因提?。嘿惏偈⒒蚪MDNA提取試劑盒提取外周血DNA，溶解于pH 8.0的TE緩沖液中，-80 ℃低溫冰箱中保存。⑵PCR擴增：根據(jù)GenBank中的基因序列用DNAstar軟件設(shè)計上下游引物，上游引物5’-GCGATTTCGGAGGATGGAGAAATAGC-3’，下游引物5’-CCGGGTACTCACAGAGTCTGCGACCTG-3’［9］，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PCR產(chǎn)物長度為227 bp。反應(yīng)體系25 μL：去離子水13 μL，DNA模板（150～200 ng）2 μL，10×Buffer 2.5 μL，10×dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶 1 U。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；之后72 ℃終止延伸5 min。⑶酶切鑒定反應(yīng)體系：去離子水9 μL，10×Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物7 μL，Tth111Ⅰ 2 μL；37 ℃水浴中酶切過夜。⑷酶切結(jié)果的分析：限制性酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（50 v，40 min）分離后觀察結(jié)果。結(jié)果分析：TSHR C253A多態(tài)性檢測，若為純合變異，PCR擴增片斷經(jīng)Tth111Ⅰ酶切后（CCC/ACC），可產(chǎn)生201和16 bp 2個片斷；當此位點為雜合變異型時，酶切后得到227、201和16 bp 3個片斷。

1.2.3 Tg A7589G 多態(tài)性檢測 ⑴基因提?。嘿惏偈⒒蚪MDNA提取試劑盒提取外周血DNA，溶解于pH 8.0的TE緩沖液中，-80 ℃低溫冰箱中保存。⑵PCR擴增：根據(jù)GenBank中的基因序列用DNAstar軟件設(shè)計上下游引物，上游引物5’-AACTCAGACAGTCTGGCTTCC-3’，下游引物 5’-CGACGCGGGCATCTGAGTCCT-3’，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物長度為240 bp。反應(yīng)體系25 μL：去離子水13 μL，DNA模板（150～200 ng）2 μL，10×Buffer 2.5 μL，10×dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶 1 U。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性60 s、58 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)，之后72 ℃終延伸5 min。⑶酶切鑒定反應(yīng)體系：去離子水9 μL，10×Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物7 μL，TaqⅠ 2 μL。37 ℃水浴中酶切過夜。⑷酶切結(jié)果的分析：限制性酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（60 v，30 min）分離后觀察結(jié)果。結(jié)果分析：Tg A7589G多態(tài)性，若是純合變異，PCR擴增片斷經(jīng)TaqⅠ酶切后，可產(chǎn)生186和54 bp 2個片斷；當此位點為雜合變異型時，酶切后得到240、186和54 bp 3個片斷。

1.3 統(tǒng)計處理 運用Hardy-Weinberg平衡法則檢測樣本的群體代表性，采用SPSS 11.0統(tǒng)計處理軟件將實驗數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，并計算相對危險度和95%可信區(qū)間。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TSHR C253A基因型與等位基因的頻率分布 由于C/A多態(tài)性的純合基因變異數(shù)量非常少，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，本研究將雜合變異和純合變異相結(jié)合。NMTC組CC基因型的頻率為89.8%（158/176），CA+AA基因型的頻率為10.2%（18/176）， 對照組CC基因型的頻率為87.5%（161/184），CA+AA基因型的頻率為12.5%（23/184）。NMTC組CA+AA基因型頻率與對照組沒有明顯差異（χ2=0.46，P=0.497）。NMTC組A等位基因頻率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.941，P=0.332）。TSHR C253A PCR產(chǎn)物及限制性酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 TSHR C253A PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Result of electrophoresis of the products of TSHR C253A in an agarose gel

2.2 Tg A7589G基因型與等位基因的頻率分布 NMTC組AA基因型頻率為17%(30/176)，AG基因型頻率為53.4%（94/176），GG基因型的頻率為29.6%（52/176）。對照組AA基因型頻率為26.1%（48/184），AG基因型頻率為54.9%（101/184），GG基因型的頻率為19%（35/184）。NMTC組AG+GG基因型與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.333，P=0.037）。NMTC組A等位基因頻率為43.75%（154/352），G等位基因頻率為56.25%（198/352）。對照組A等位基因頻率為53.5%（197/368），G等位基因頻率為46.5%（171/368）。NMTC組G等位基因頻率明顯高于對照組（χ2=6.891，P=0.009）。2組復(fù)合數(shù)據(jù)的分析：與純合性相關(guān)的ORs為1.55（95%CI: 1.1～2.3）。Tg A7589G PCR產(chǎn)物及限制性酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

圖2 Tg A7589G PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Result of electrophoresis of the products of Tg A7589G in an agarose gel

3 討 論

TSHR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，與促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）結(jié)合發(fā)揮作用，是濾泡細胞生長和發(fā)揮功能的主要刺激因子。已經(jīng)在家系研究中發(fā)現(xiàn)，TSHR的基因突變與甲狀腺功能亢進和甲狀腺增生癥存在相關(guān)性［10］。TSHR C253A多態(tài)性導(dǎo)致了編碼的氨基酸P52T的改變，此段氨基酸位于TSHR的胞外區(qū)。變異的蛋白質(zhì)在52位置上缺少一個β旋轉(zhuǎn)，這可能改變受體的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致TSH作用的異常。

研究發(fā)現(xiàn)TSHR基因的變異與一些良性甲狀腺疾病的高風險性相關(guān)。良性甲狀腺疾病例如非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（multinodular goiter，MNG）是甲狀腺非髓樣癌的強烈危險因子，TSHR的突變可能直接與腫瘤形成有關(guān)［11］。這些突變通常引起受體信號的激活，可導(dǎo)致細胞的無限制生長。因此筆者認為該基因多態(tài)性可能與NMTC的高風險性相關(guān)。本研究中TSHR C253A的A等位基因在NMTC組和對照組中的分布沒有明顯差異（P<0.05），也可能與樣本量小及抽樣誤差有關(guān)。

Tg是甲狀腺中表達量最多的蛋白質(zhì)，功能是甲狀腺激素合成的支架及甲狀腺激素和碘的儲存蛋白。甲狀腺腫在NMTC家系中較常見，且是人群中NMTC的危險因素［12］。

已有報道稱循環(huán)中Tg的水平是NMTC發(fā)生的預(yù)兆，這表明兩者之間可能存在一種因果關(guān)系［13］。本研究中Tg A7589G的G等位基因頻率在NMTC患者中分布較多，NMTC組和對照組的等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Tg A7589G可能通過一種功能性變異的線性失衡來調(diào)整發(fā)病危險度，多態(tài)性導(dǎo)致谷氨酸-精氨酸的轉(zhuǎn)變，這個變異定位于甲狀腺球蛋白的乙酰膽堿酯酶同源區(qū)。這個區(qū)的功能還不清楚，有證據(jù)表明這個區(qū)的突變與胎兒甲狀腺腫有關(guān)［14］。而且，小鼠模型上這個區(qū)的突變導(dǎo)致了明顯結(jié)構(gòu)異常的Tg分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蓄積，最終導(dǎo)致了先天性甲狀腺腫和甲狀腺機能亢進［15-16］。

研究數(shù)據(jù)表明Tg的遺傳變異可能對NMTC危險度有直接作用或通過調(diào)整甲狀腺腫的易感性來調(diào)整危險度。盡管NMTC危險度與G等位基因的相關(guān)性很微弱，但普通人群中R等位基因的高頻率意味著其很有可能對NMTC腫瘤的發(fā)生率有著重要的影響。高加索人群中該等位基因的頻率是50%，雜合性和純合性變異存在于近1/3的患者。本研究中甲狀腺球蛋白基因A7589G在NMTC組和對照組存在多態(tài)性，G等位基因可能為中國北方甲狀腺非髓樣癌發(fā)病的易感基因。

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