何爽，張萬強(qiáng)，朱嘉，孔煥宇

實(shí)驗(yàn)研究

中藥髓復(fù)康對恒河猴急性脊髓損傷后脊髓組織勿動蛋白-A表達(dá)的影響

何爽1，張萬強(qiáng)2，朱嘉2，孔煥宇2

目的：觀察急性脊髓損傷后中藥髓復(fù)康干預(yù)對脊髓組織勿動蛋白-A表達(dá)的影響。方法：成年雄性恒河猴14只，其中10只用于制備T12胸髓左側(cè)半橫斷損傷模型，并將其隨機(jī)分為髓復(fù)康組和模型組，另外4只設(shè)為正常對照組。觀察評估恒河猴脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況，采用原位雜交法及免疫組化法檢測各組Nogo-A的表達(dá)量。結(jié)果：給藥30 d后，髓復(fù)康組患肢神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于模型組；脊髓損傷后Nogo-AmRNA及其蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)及其陽性產(chǎn)物的OD值均明顯升高，與正常組比較差異顯著（P<0.05）；其中髓復(fù)康組Nogo-AmRNA及其蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)和其陽性產(chǎn)物的OD值都明顯低于模型組。結(jié)論：中藥髓復(fù)康對脊髓損傷后恒河猴脊髓中Nogo-A的表達(dá)有一定的抑制作用，為神經(jīng)的修復(fù)和再生提供有利的微環(huán)境，促進(jìn)了脊髓損傷后恒河猴運(yùn)動神經(jīng)功能的恢復(fù)。

中草藥；脊髓損傷；恒河猴；Nogo-A

近年來研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervesystem,CNS)微環(huán)境中存在神經(jīng)元軸突再生抑制因子，是導(dǎo)致成年哺乳動物CNS缺乏自我再生和修復(fù)能力的原因之一。勿動蛋白-A（Nogo-A）是CNS損傷后抑制軸突再生的重要因子，本實(shí)驗(yàn)通過建立脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）模型，對各組動物損傷后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評詁；采用原位雜交及免疫組化的方法觀察髓復(fù)康對急性脊髓損傷后Nogo-A表達(dá)變化的影響，以探討髓復(fù)康對CNS神經(jīng)軸突再生所起的作用。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑中藥髓復(fù)康（SFK）由生黃芪、川芎、赤芍、銀杏葉、燈盞花、紅花、葛根和三七等8味中藥草藥組成，水煎，生藥濃度為2.5 g/mL；Nogo-A原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，Nogo-A一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型制備和分組成年雄性恒河猴14只(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號：0019631)，6 500～7 500 g,隨機(jī)分為3組，正常組，4只；模型組，5只；髓復(fù)康組5只。后兩組采用雙盲法復(fù)制脊髓T12右側(cè)半橫斷損傷模型[1]。

1.3 給藥方法術(shù)后髓復(fù)康組灌喂髓復(fù)康水煎液，1次/d，共30 d，每次生藥劑量為8.55 g/kg。第1次喂藥在麻醉清醒后4 h以內(nèi)，其余兩組恒河猴按髓復(fù)康組方式灌喂等量的生理鹽水。

1.4 取材和切片于術(shù)后30 d，在5%戊巴比妥鈉（0.1 mL/kg）配合速眠新（0.1 mL/kg）麻醉下，經(jīng)左心室升主動脈插管，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛PBS溶液灌注固定。以半橫斷損傷區(qū)為中心，取出長1c m的脊髓組織，投入4%多聚甲醛內(nèi)繼續(xù)固定24 h。按常規(guī)制備脊髓損傷區(qū)的石蠟冠狀切片，切片厚5μm，連續(xù)切片，每隔5張取1張，每只動物取3張切片。

1.5 行為學(xué)觀察觀察術(shù)后1、7、14、21、30 d右后肢自主運(yùn)動、肌力的變化，根據(jù)文獻(xiàn)[2-3]對肌力進(jìn)行評價(jià),將肌力分為6級，最低為0級，最高為5級屬正常。

1.6 脊髓組織原位雜交檢測Nogo-A寡核苷酸探針序列為：

①5’—GCTCT TCCTG CTGCA TCTGA GCCTG TGATA—3’

②5’—TTCAG AATTA GAATA CTCAG AAATG GGATC—3’

③5’—GCAGA TAGAT CATTA TCTAG GACTT GCAAA—3’

以地高辛標(biāo)記法，按說明書進(jìn)行操作，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.7 脊髓組織免疫組化染色方法參照試劑盒說明書，DAB顯色。

1.8 圖像分析脊髓切片上隨機(jī)選取8個(gè)不同視野，用Image Pro Plus程序?qū)Σ杉膱D像進(jìn)行半定量分析，測定Nogo-A的陽性細(xì)胞數(shù)和其陽性表達(dá)物的平均光密度值（OD）。以8個(gè)視野的均值作為評價(jià)該樣本Nogo-A陽性表達(dá)的數(shù)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)用±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析和q檢驗(yàn)，顯著水平為P﹤0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物行為學(xué)觀察術(shù)后1 d，各損傷組右下肢肌力為0級，均表現(xiàn)為完全癱瘓，對針刺無反應(yīng)。術(shù)后7 d，模型組無明顯好轉(zhuǎn)；髓復(fù)康組患肢對刺激有反應(yīng)，肌力可達(dá)到1級。術(shù)后14～21 d，模型組患肢肌萎縮明顯，肌力基本達(dá)到1級；髓復(fù)康組患肢開始出現(xiàn)自主活動，可以部分負(fù)重，多數(shù)患肢達(dá)到3級。術(shù)后30 d，模型組多數(shù)肌力接近2級，小關(guān)節(jié)無明顯活動；髓復(fù)康組有3只患肢肌力可達(dá)到4級，能主動握持，可行走。另外2只肌力也達(dá)到3級水平。正常組動物身體良好（見表1）。

表1 各組恒河猴各時(shí)間點(diǎn)肌力評分(s)

表1 各組恒河猴各時(shí)間點(diǎn)肌力評分(s)

注：與正常組比較，＊＊P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

組別正常組模型組髓復(fù)康組n4 5 5 1 d 5.00±0.00 0.00±0.00＊＊0.00±0.00＊＊7 d 5.00±0.00 0.00±0.00＊＊0.80±0.45＊＊△△14 d 5.00±0.00 0.60±0.55＊＊1.60±0.55＊＊△△21 d 5.00±0.00 1.00±0.00＊＊2.60±0.55＊＊△△30 d 5.00±0.00 1.60±0.55＊＊3.60±0.55＊＊△△

2.2 脊髓組織Nogo-AmRNA原位雜交結(jié)果Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胞核無色（圖1）。脊髓損傷后各手術(shù)組Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，OD值明顯升高，其中髓復(fù)康組（圖2）陽性細(xì)胞數(shù)及OD值明顯低于模型組（圖3），差異有顯著性(P＜0.05）（見表2）。

2.3Nogo-A免疫組化結(jié)果Nogo-A免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要在胞漿，脊髓損傷后模型組（圖4）Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，OD值明顯升高，與正常組（圖5）比較差異明顯；髓復(fù)康組（圖6）Nogo-A表達(dá)明顯下降，與模型組相比呈顯著差異（P＜0.01)（見表3）。

3 討論

成年哺乳動物CNS再生困難的主要因素之一，就是CNS內(nèi)環(huán)境限制了軸突再生,這種限制作用與髓鞘產(chǎn)生的神經(jīng)生長抑制因子有關(guān)。目前,人們已經(jīng)在CNS髓磷脂中分離出了多種抑制神經(jīng)再生的因子,其中Nogo蛋白(勿動蛋白)是最重要的因子之一，在CNS神經(jīng)纖維的再生修復(fù)中起重要作用[4]。

表2 Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均光密度(±s)

表2 Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均光密度(±s)

注：與正常組比較，＊P<0.05,＊＊P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

組別正常組模型組髓復(fù)康組n4 5 5細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)）11.00±1.58 29.80±3.89＊＊15.60±1.67＊△平均光密度（OD）0.207 4±0.006 8 0.272 3±0.008 5＊＊0.253 0±0.008 2＊＊△

表3 Nogo-A免疫組化陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均光密度±s)

表3 Nogo-A免疫組化陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和平均光密度±s)

注：與正常組比較，＊P<0.05,＊＊P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

組別正常組模型組髓復(fù)康組平均光密度（OD）0.199 6±0.008 5 0.275 6±0.019 5＊＊0.233 7±0.013 9＊△△n4 5 5細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)）12.2±3.11 27.8±2.39＊23.6±1.14＊△△

圖1 正常組Nogo-A 20×原位雜交染色

圖2 髓復(fù)康組Nogo-A 20×原位雜交染色

圖3 模型組Nogo-A 20×原位雜交染色

圖4 模型組Nogo-A20×免疫組化染色

圖5 正常組Nogo-A 20×免疫組化染色

圖6 髓復(fù)康組Nogo-A 20×免疫組化染色

2000 年，抑制CNS軸突再生蛋白Nogo的基因，相繼被美國、英國、瑞士的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室成功鑒定和克隆[5-7]，為中樞神經(jīng)軸突再生的研究帶來了新的希望。Nogo基因編碼的蛋白稱Nogo蛋白，Nogo蛋白包括3個(gè)不同的Nogo異構(gòu)體[6],即NogoA、Nogo B和Nogo C,其中Nogo-A最長、具有最強(qiáng)的軸突生長抑制活性,在成年哺乳動物CNS具有抑制軸突生長錐的生長和再生的能力。NogoA主要位于CNS髓鞘中，在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)檢測脊髓損傷恒河猴Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Nogo-A在正常恒河猴脊髓中有所表達(dá)，脊髓損傷后，Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，但髓復(fù)康組Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表達(dá)與模型組比較均明顯下調(diào)，兩組比較差異顯著（P＜0.01）。說明SCI后，細(xì)胞隨即作出相應(yīng)蛋白重組反應(yīng)，啟動抑制機(jī)制，阻止神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生；應(yīng)用髓復(fù)康后，在一定程度上抑制了Nogo-AmRNA的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Nogo-A蛋白合成減少，以適應(yīng)神經(jīng)軸突再生的需要。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，急性脊髓損傷是因?yàn)楸┝岸矫}，其基本病理變化是瘀血阻絡(luò)。筋脈肌肉失去氣血之溫煦濡養(yǎng)，則見肢體麻木，感覺運(yùn)動障礙。方中黃芪補(bǔ)氣升陽，培補(bǔ)后天，強(qiáng)壯肌肉四肢，為君藥；川芎、赤芍、銀杏葉、燈盞花、紅花和三七等共奏活血化瘀，舒筋活絡(luò)之效，共為臣藥；葛根升舉陽氣，益胃生津可助黃芪強(qiáng)壯肌肉，培補(bǔ)后天，為佐藥；川芎“上行頭目，下行血?！睘橐?jīng)之藥，引藥直達(dá)病所，使氣血流暢，督脈、宗筋得以濡養(yǎng)。全方共具強(qiáng)筋骨，壯腰膝，健督脈之功用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在SCI早期應(yīng)用髓復(fù)康治療，對運(yùn)動功能的恢復(fù)有良好的促進(jìn)作用。其機(jī)制之一可能是通過抑制Nogo-A表達(dá)，減輕其對軸突生長的抑制作用。SFK的這種作用及其所創(chuàng)造的微環(huán)境將有利于神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生，從而促進(jìn)脊髓損傷所造成的神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)，但是這一機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1]胥少汀,郭世紱.脊髓損傷基礎(chǔ)與臨床[M[.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:298.

[2]Tator CH.Acute spinal cord injury in primates producted by an in?flatable extrdural cuff[J].Can J Surg,1973,16(3):222.

[3]孟曉梅,游思維,林英華,等.脊髓半切后脛后神經(jīng)體感誘發(fā)電位與后肢運(yùn)動功能的相關(guān)性研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2002，18(3):144.

[4]JiB,LiM,Budel S,et al.Effect of combined treatment with methyl?prednisolone and soluble Nogo-66 receptor after rat spinal cord in?jury[J].Eur J Neurosci,2005,22(3):587.

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（收稿：2010-01-06修回：2010-06-20）

（責(zé)任編輯劉洪斌田在善）

Effect of Chinese Herbal Medicine Suifukang(髓復(fù)康)on Expressin of Nogo-A Following Spinal Cord Injury in Rhesus Monkeys

He Shuang,Zhang Wanqiang,Zhu Jia,et al.The Special Educational College,

Changchun University,Changchun(130022),China

ObjectiveTo investigate the effects of Chinese Herbal Medicine Suifukang(SFK)(髓復(fù)康)on the changes of the functional recovery and the expression of Nogo-A following spinal cord injury in rhesus mon?keys.MethodsThere were fourteen adult rhesus monkeys and ten of them

left spinal cord hemisec?tion at T12,and then randomly divided into two groups:SFK group(5)and control group(5).The other 4 mon?keys remained in the normal group.The expression of Nogo-A mRNA was detected by in-situ hybridization and the expression of Nogo-A protein was detected by immunohistochemistry.ResultsThe functional recovery of the nerve of the affected limb in the SFK group was better than that in the model group;The positive cells of No?go-A mRNA and its OD value in the model group were more than in other groups(P<0.05);The Nogo-A mRNA positive cells and its OD value in SFK group were more than those in normal group(P<0.05).The chang?es of Nogo-A protein positive cells number and its OD value were similar to those of Nogo-A mRNA. ConclusionSFK can restrain the expression of Nogo-A obviously.It is possible to improve the microenviron?ment in the injured spinal cord for regeneration of nervous tissue,and facilitate the movement ability of injured spinal cord in rhesus monkeys.

Chinese herbal medicine,spinal cord injury,rhesus monkey,Nogo-A,SFK

R285.5

A

1007-6948(2010)05-0551-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.012

本課題受國家自然科學(xué)基金資助（30572304）

1．長春大學(xué)特殊教育學(xué)院針推系（長春130022）

2．中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院

孔煥宇，Tel：010-64014411-2572；E-mail：konghy55@ 163.com