翟文亮，陳志文，王興盛，練克儉，周 亮

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類與神經(jīng)障礙后炎癥反應(yīng)、傷口愈合、細(xì)胞凋亡以及其他病理過程密切相關(guān)的蛋白水解酶家族[1]，近年來在脊髓損傷，尤其是繼發(fā)性脊髓損傷中的作用越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察兔在不同時(shí)間點(diǎn)損傷段脊髓組織中MMP-2、12表達(dá)的變化，并對(duì)其與損傷程度的相關(guān)性進(jìn)行探討，以闡明MMPs在脊髓損傷發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

Trizol（美國Gibco公司），Taq酶、RNA酶抑制劑、TBE、Loading buffer（上海捷蘭生物技術(shù)有限公司），熒光定量專用Taq酶（美國Promega公司），免疫組化檢測試劑盒EnVisionTM Two-step Histostaining Reagent（丹麥DAKO公司），MMP-2 rabbit多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)公司）；DY-50IB型電泳儀、H6-I微型電泳槽（上海琪特分析儀器有限公司），基因擴(kuò)增儀TC-96/T/H（a）（杭州大和熱磁電子有限公司），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7000 Real Time PCR System），凝膠成像系統(tǒng)GIS-2008（上海天能科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c分組

健康新西蘭大耳白家兔135只[福建省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SYXK(軍)2008-047]，體重2.5～3.0 kg，雌雄不拘。隨機(jī)分成3組：全癱組（A組）、不全癱組（B組）和假手術(shù)對(duì)照組（C組），每組45只。A、B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈全麻后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒，以T8棘突為中心作縱形切口，長度約2 cm，向兩側(cè)推開骶棘肌，咬除T7～T8棘突、椎板，暴露脊髓8 mm×6 mm，安裝自制Allen打擊架，打擊導(dǎo)管對(duì)準(zhǔn)打擊中心，并使之垂直緊貼硬脊膜，打擊頭徑2 mm，高度4 cm。A組用重20 g（打擊勢能約為80 gcm）、B組用重10 g（打擊勢能約為40 gcm）打擊致傷脊髓后關(guān)閉切口。對(duì)照組僅行椎板切除術(shù)。術(shù)后前3日青霉素20萬單位/d肌注，每日2次，定時(shí)擠壓下腹排尿3次/d至自主排尿恢復(fù)。

1.3 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

分別于術(shù)前1 h，術(shù)后麻醉清醒后6 h，損傷后24 h、48 h、7 d、14 d各組家兔隨機(jī)抽取7只放于開闊空間內(nèi)觀察動(dòng)物雙后肢運(yùn)動(dòng)功能，采用改良Tarlov評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià)：0分：完全癱瘓，針刺下肢無反應(yīng)；1分：完全癱瘓，針刺下肢有反應(yīng)，但肢體不能活動(dòng)；2分：肢體可活動(dòng)，但不能站立或站立不穩(wěn)；3分：可站立，但無法行走；4分：可行走數(shù)步，但不能穩(wěn)定；5分：能緩慢行走，但不靈活；6分：正常行走。

1.4 標(biāo)本采集和組織學(xué)觀察

3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后6 h、24 h、48 h、7 d、14 d各時(shí)間點(diǎn)各取5只，靜脈注射麻醉后按原手術(shù)切口切開，取出距損傷中心區(qū)（對(duì)照組取假手術(shù)區(qū)）上下寬約0.5 cm、長約1.5 cm的脊髓組織，取其1/3（長約0.5 cm）以4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，蘇木精—伊紅染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。剩余2/3的骨髓組織（長約1.0 cm）標(biāo)記后液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MMP-2免疫組織化學(xué)染色法檢測

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按不同的時(shí)間點(diǎn)將取出備用的脊髓組織（長約1.0 cm）置于10%中性緩沖福爾馬林（pH 7.4）固定液中固定，采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素試劑盒（博士德生物工程有限公司）染色（SP法），具體步驟如下：（1）常規(guī)石蠟包埋切片；（2）石蠟切片常規(guī)脫蠟；（3）3%過氧化氫，室溫反應(yīng)10 min，蒸餾水漂洗2 min×3次；（4）將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電冷卻，反復(fù)1～2次，0.01 mol/L PBS洗滌2 min × 3次；（5）加正常山羊血清封閉液，室溫下孵育2 h；（6）滴加一抗MMP-2兔多克隆抗體（博士德生物工程有限公司，濃度1：100），37℃孵育過夜；（7）滴加生物素化羊抗兔 IgG，室溫下反應(yīng)20 min；（8）滴加HRP工作液，在室溫下反應(yīng)20 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min× 3次；（9）DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)采用替代法，用PBS代替一抗、二抗及HRP工作液做上述操作。免疫組化檢測MMP-2的表達(dá)結(jié)果判讀：參照試劑盒說明記錄每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞胞漿棕黃色染色，計(jì)數(shù)高倍視野內(nèi)染色陽性細(xì)胞（每個(gè)標(biāo)本選5張切片，在200倍光鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共計(jì)30個(gè)視野），計(jì)算陽性率，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6 MMP-12 Real-Time PCR熒光定量檢測

取材的時(shí)間點(diǎn)與MMP-2組相同。實(shí)施熒光定量PCR按照試劑盒說明操作：（1）組織總RNA提取。（2）cDNA 的合成：引物 MMP-12 Loaded-504序列5'-TTT TGA TGG CAG AGG TGG TG-3'和MMP-12 Loaded-757序列5'-TGC CAC GTA TGT CAT CAG CA-3'。其反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因：GAPDH的引物上、下游分別是5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'和5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，利用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶雜交信號(hào)強(qiáng)度并與內(nèi)參照GAPDH條帶相比，計(jì)算出各mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson積差法進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

傷后6 h，A組損傷節(jié)段灰質(zhì)內(nèi)有大片出血灶，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤（圖1A）；傷后24 h，大量神經(jīng)細(xì)胞壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬現(xiàn)象明顯（圖1B）；傷后7 d，損傷中心壞死空腔形成，邊緣有大量膠質(zhì)細(xì)胞（圖1C）；傷后14 d，炎性反應(yīng)更加明顯。B組損傷后各時(shí)間點(diǎn)上述病理改變均較A組明顯減輕（圖2）。C組脊髓組織各形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，各層細(xì)胞排列整齊，無水腫。

2.2 兔后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

3 組改良Tarlov評(píng)分在傷后各時(shí)間點(diǎn)相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A組傷后同時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均低于B組（P＜0.05），C組各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分維持在正常恒定水平（表1）。

2.3 MMP-2、12表達(dá)

A、B、C 3組各時(shí)間點(diǎn)均有MMP-2 mRNA表達(dá)，C組免疫組化染色未見MMP-2高表達(dá)（圖3），且各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較為恒定（表2）。傷后24 h A、B組MMP-2表達(dá)達(dá)到高峰（圖4），傷后7 d A、B組MMP-2仍有高表達(dá)（圖5）。傷后同時(shí)間點(diǎn)比較，A、B組MMP-2表達(dá)明顯高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組MMP-2表達(dá)在傷后24 h、48 h、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)高于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而兩組在傷后6 h、14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MMP-12的表達(dá)結(jié)果與MMP-2類似（表3）。

圖1 全癱組脊髓損傷后組織學(xué)觀察

表1 三組改良Tarlov評(píng)分比較（n=42，±s）

表1 三組改良Tarlov評(píng)分比較（n=42，±s）

注：*與C組比較，P＜0.05；#與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F值P值傷后1 h 6.06.06.00.0001.000傷后6 h 0.0*#2.1±0.2*5.2±0.175.8740.000傷后24 h 0.0*#1.9±0.2*5.6±0.181.2760.000傷后48 h 0.0*#2.6±0.1*5.9±0.089.2310.000傷后7 d 1.0±0.1*#3.1±0.1*6.09.6920.001傷后14 d 1.4±0.1*#3.4±0.2*6.08.5640.002

圖2 不全癱組脊髓損傷后組織學(xué)觀察

表2 急性脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率（%，n=25，±s）

表2 急性脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率（%，n=25，±s）

注：*與C組比較，P＜0.05；#與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F值P值傷后6 h 28.7±0.6*16.0±0.5*6.1±2.53.3100.121傷后24 h 61.0±1.2*#45.1±0.9*7.2±1.96.1450.014傷后48 h 57.5±0.7*#42.4±0.5*6.6±0.212.8850.000傷后7 d 51.5±0.6*#39.7±0.5*6.4±0.111.6080.00144.9±1.2*36.2±0.7*6.5±0.23.0630.123傷后14 d

表3 急性脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物MMP-12實(shí)時(shí)熒光定量CT值（%，n=25，±s）

表3 急性脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物MMP-12實(shí)時(shí)熒光定量CT值（%，n=25，±s）

注：*與C組比較，P＜0.05；#與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F值P值傷后6 h 23.7±0.9*21.2±0.6*10.5±0.53.1540.125傷后24 h 35.4±1.2*#26.4±0.8*10.6±0.55.9780.018傷后48 h 33.9±0.7*#25.7±1.0*10.2±0.310.5890.000傷后7 d 27.9±0.6*#21.8±0.9*10.8±0.49.6120.001傷后14 d 21.0±1.2*20.0±0.5*10.4±0.43.2300.120

2.4 脊髓損傷程度與MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率及MMP-12熒光定量CT值相關(guān)性分析

脊髓損傷程度與MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率及MMP-12熒光定量CT值相關(guān)性分析采用Pearson積差相關(guān)分析（圖6，7）。脊髓損傷后A、B組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率與兔改良Tarlov評(píng)分的相關(guān)系數(shù)為r=-0.887，P=0.000；A、B組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-12實(shí)時(shí)熒光定量CT值與兔改良Tarlov評(píng)分的相關(guān)系數(shù)為r=-0.841，P=0.002。說明MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率和MMP-12實(shí)時(shí)熒光定量CT值與兔運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

圖6 MMP-2陽性細(xì)胞表達(dá)率與兔改良Tarlov評(píng)分的關(guān)系

圖7 MMP-12實(shí)時(shí)熒光定量CT值與兔改良Tarlov評(píng)分的關(guān)系

3 討論

作為高致殘疾病之一，急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）后的神經(jīng)功能修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界極具挑戰(zhàn)性的難題。目前針對(duì)脊髓損傷的相關(guān)研究主要集中于ASCI后脊髓內(nèi)繼發(fā)性病理損傷的預(yù)防和治療。研究認(rèn)為，多種因素參與了脊髓的繼發(fā)性損傷：局部缺血和再灌注損傷、血—脊髓屏障破壞、自由基生成、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡以及炎癥介質(zhì)、一氧化氮、內(nèi)皮素、血管內(nèi)皮生長因子/滲透性因子、血小板活化因子、興奮性氨基酸等的作用。繼發(fā)性脊髓損傷正是上述神經(jīng)生化機(jī)制和血管機(jī)制相互關(guān)聯(lián)、不斷惡化的過程。故其治療主要針對(duì)ASCI后出血、水腫、微循環(huán)障礙、局部組織自由基生化改變等一系列繼發(fā)性損傷。

MMPs是一組鋅依賴的蛋白水解酶，具有降解多種細(xì)胞外基質(zhì)（excellular matrix，ECM）成分（如膠原、層粘素、明膠、彈性硬蛋白、粘連蛋白及蛋白多糖等）的功能，因此對(duì)需要基質(zhì)重建的生理過程如生長發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及修復(fù)等起到重要作用[2]；此外，MMPs還與生理機(jī)能調(diào)節(jié)、信號(hào)發(fā)送、血管生成以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等密切相關(guān)，在腫瘤轉(zhuǎn)移、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)等）、AIDS及創(chuàng)傷等多種疾病的發(fā)展過程中有異常表達(dá)[3-5]。

Agrawal等[6]認(rèn)為，MMPs對(duì)正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程起到了調(diào)節(jié)作用，但當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)障礙時(shí)，MMPs成員則表現(xiàn)為異常的表達(dá)上調(diào)。近年來大量基礎(chǔ)研究表明，MMPs參與了脊髓損傷后的多個(gè)病理過程[7-11]。ECM由細(xì)胞間的多種蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組成，構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境，具有支持、連接、營養(yǎng)和防御等生理作用，而血管基底膜與ECM是維持血—脊髓屏障完整的重要結(jié)構(gòu)，MMPs可以通過降解ECM成分使血—脊髓屏障受損，通透性增加，毛細(xì)血管內(nèi)的水分與血漿蛋白外滲，致細(xì)胞間隙內(nèi)水分增多，進(jìn)而形成脊髓水腫[10]。研究還證實(shí)，MMPs在脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等事件中扮演了重要角色[1,11]。MMP-2、12是MMPs的重要成員，在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)，在損傷后脊髓組織中呈高表達(dá)。Buss等[12]的相關(guān)研究顯示，MMP-1、2、9、12均參與人類的繼發(fā)性脊髓損傷過程，認(rèn)為它們的高表達(dá)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)破裂、中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤而引發(fā)破壞性炎性事件，并通過增強(qiáng)血—脊髓屏障通透性來進(jìn)一步加重脊髓損傷。de-Castro等[8]報(bào)道鼠脊髓損傷后MMP-2、9的高表達(dá)，MMP-9的活性在12～24 h達(dá)到高峰，致傷后5 d MMP-2仍維持在較高水平，因而推測MMP-2、9對(duì)脊髓損傷后ECM崩潰具有促進(jìn)作用。Dang等[11]發(fā)現(xiàn)，MMP-2轉(zhuǎn)錄在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓損傷后顯著上調(diào)，而抑制MMP-2/MMP-9活性可使脊髓損傷區(qū)域內(nèi)細(xì)胞凋亡明顯減少，提示傷后MMP-2的上調(diào)伴隨著神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞凋亡可通過降低MMP-2、9活性來實(shí)現(xiàn)，這一結(jié)果支持脊髓損傷后MMP-2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的推論，證實(shí)脊髓損傷治療干預(yù)中應(yīng)用MMP-2抑制劑抑制凋亡進(jìn)而減輕脊髓損傷程度的可行性。本實(shí)驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2、12在急性脊髓損傷后的表達(dá)不僅存在量的顯著性不同，且定位、時(shí)空分布同樣存在差異[13]；本實(shí)驗(yàn)對(duì)兔ASCI后MMP-2、12的表達(dá)及與損傷程度、損傷后時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)性觀察結(jié)果亦顯示，脊髓損傷后6 h MMP-2、12表達(dá)增加，傷后24 h達(dá)高峰，并持續(xù)高水平表達(dá)至第7天，假手術(shù)組則維持在較恒定的低水平；且MMP-2、12的表達(dá)水平與脊髓損傷的程度呈負(fù)相關(guān)，揭示了MMP-2、12在ASCI后繼發(fā)性損傷發(fā)展過程中的重要作用，同時(shí)也表明，ASCI后早期應(yīng)用MMPs抑制劑下調(diào)MMP-2及MMP-12的表達(dá)水平可能會(huì)進(jìn)一步減輕脊髓繼發(fā)性損傷的程度。

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