張奎渤，張加芳，鄭召民，劉 輝，張勁軍，王建儒，王太平，劉先國(guó)

椎間盤(pán)退變及其繼發(fā)的一系列疾病是導(dǎo)致慢性腰腿痛的重要原因[1,2]。目前，以修復(fù)/再生退變椎間盤(pán)為目的的各種生物治療策略，如注射生長(zhǎng)因子、基因治療、細(xì)胞移植（髓核細(xì)胞/干細(xì)胞）等方法是國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，為了驗(yàn)證各種治療手段的效果，現(xiàn)有的絕大部分研究均是將椎間盤(pán)生化成分的改變或影像學(xué)上的改善作為標(biāo)準(zhǔn)，缺乏與臨床癥狀密切相關(guān)的、更具實(shí)際意義的評(píng)價(jià)方法[3,4]。在本研究中，我們分別利用大鼠正常與退變的椎間盤(pán)髓核組織，建立實(shí)驗(yàn)性髓核突出致神經(jīng)根性疼痛的動(dòng)物模型，通過(guò)動(dòng)物的行為學(xué)測(cè)試與免疫組化分析，探討椎間盤(pán)退變與疼痛之間的直接關(guān)系，并為驗(yàn)證各種生物治療的效果提供一個(gè)較好的疼痛評(píng)價(jià)模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠72只，體重200～250 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。為保持大鼠的生物節(jié)律，飼養(yǎng)室每天早晨8：00至20：00開(kāi)燈，其余時(shí)間熄燈。行為學(xué)測(cè)試均在9:00至18:00之間進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)操作（包括飼養(yǎng)條件）嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究綱要及所在單位動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求實(shí)施完成。

采用隨機(jī)方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：空白對(duì)照（NC）組（n=18），假手術(shù)對(duì)照（SC）組（n=19），正常髓核（N-NP）組（n=16），退變髓核（P-NP）組（n=19）。每組中各有8只用于行為學(xué)測(cè)試，8只用于免疫組化取材分析，其余用于椎間盤(pán)退變病理學(xué)染色與MRI評(píng)價(jià)。

1.2 椎間盤(pán)退變模型的建立與評(píng)價(jià)

在P-NP組，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后，觸診大鼠尾椎根部，依次定位Co 4/5及Co 8/9椎間隙并標(biāo)記。無(wú)菌條件下，在兩部位分別做一個(gè)長(zhǎng)約0.5 cm的小切口，切開(kāi)皮膚、皮下組織顯露椎間盤(pán)，用21G注射器針頭平行于終板刺入纖維環(huán)，以尖端夾持的血管鉗控制深度在3 mm左右，刺入后停留數(shù)秒鐘拔出，縫合皮膚。SC組僅切開(kāi)顯露不做穿刺。正式實(shí)驗(yàn)前反復(fù)練習(xí)椎間隙定位及穿刺等操作，并以X線透視核實(shí)，盡量避免失誤。

2 周后，分別應(yīng)用MRI及蘇木精—伊紅染色評(píng)價(jià)椎間盤(pán)退變的發(fā)生。其中MRI影像學(xué)評(píng)估采用1.5 T MAGNETOM SYMPHONY QUANTUM型磁共振成像儀配合動(dòng)物專用線圈（SIEMENS，德國(guó)）。病理學(xué)檢查則在取材后將標(biāo)本按常規(guī)石蠟包埋，4 μm縱向切片，常規(guī)蘇木精—伊紅染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)性髓核突出模型的建立

麻醉方法同上，大鼠取俯臥位，無(wú)菌條件下切開(kāi)皮膚和皮下組織，緊貼棘突左側(cè)分離椎旁肌，顯露L5～S1水平左后方結(jié)構(gòu)，手術(shù)顯微鏡下行L5左側(cè)半椎板及L5～L6小關(guān)節(jié)切除，小心顯露L5左側(cè)神經(jīng)根及背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）。在大鼠尾部做切口，分別取出兩個(gè)節(jié)段的椎間盤(pán)髓核組織，置于顯露的神經(jīng)根及DRG處，注意小心操作勿損傷神經(jīng)根及脊髓。髓核為膠凍樣物質(zhì)，可輕柔粘附于神經(jīng)表面，無(wú)需固定。然后逐層關(guān)閉切口。N-NP組移植的是正常尾椎間盤(pán)髓核，P-NP組移植的是行尾椎根部纖維環(huán)穿刺后的髓核，而SC組僅作顯露與縫合。

1.4 行為學(xué)測(cè)試與免疫組化分析

行為學(xué)測(cè)試由獨(dú)立于以上手術(shù)的觀察者完成，于手術(shù)前1天及術(shù)后1、4、7、10、14及21天分別測(cè)量大鼠后肢的機(jī)械性刺激與熱刺激閾值。機(jī)械性刺激測(cè)試前將大鼠置于觀察箱中適應(yīng)20 min。采用專用的von Frey纖維筆，強(qiáng)度共有10個(gè)等級(jí)（3.61，3.84，4.08，4.17，4.31，4.56，4.74，4.93，5.07，5.18 g）。實(shí)驗(yàn)者手持纖維筆分別刺激大鼠后爪中心部位，以中等強(qiáng)度的4.31 g起始，若無(wú)反應(yīng)，則增大一級(jí)刺激強(qiáng)度；若出現(xiàn)縮足反射，則減小一級(jí)刺激強(qiáng)度。2次刺激之間至少間隔5 s以上。分別記錄測(cè)量值后，通過(guò)Chaplan等[5]的計(jì)算方法得出50%撤足閾值（50%withdrawal threshold）：

50 %withdrawal threshold=(10[Xf+κδ])/10000式中Xf=最末次測(cè)試強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值；κ值根據(jù)撤足反應(yīng)模式查表[5]得出；δ＝10支von Frey纖維筆之間對(duì)數(shù)差值的均值。

熱刺激閾值測(cè)定是通過(guò)熱平板測(cè)試儀（Plantar Test 7370，Ugo Basile，意大利）檢測(cè)大鼠后肢足跟部皮膚對(duì)熱傷害性刺激的反應(yīng)。測(cè)試前將大鼠放置于平板測(cè)試儀的有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)約5 min，測(cè)試時(shí)將可移動(dòng)的熱輻射光源通過(guò)透明玻璃板輸出紅外線熱刺激并聚焦于大鼠后肢足跟部。熱刺激強(qiáng)度以正常大鼠光照15～20 s出現(xiàn)撤足反應(yīng)為宜。在大鼠撤足的瞬間或人為設(shè)定熱刺激34 s時(shí)（為防止長(zhǎng)時(shí)間熱刺激造成組織損傷），熱光源自動(dòng)關(guān)閉，計(jì)時(shí)器自動(dòng)停止，可準(zhǔn)確記錄大鼠熱刺激撤足潛伏期（精確度達(dá)0.1 s）。以5 min的時(shí)間間隔對(duì)雙側(cè)后足各測(cè)3次，3次撤足潛伏期的均值用于最后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

手術(shù)后第4天及第14天，各組分別進(jìn)行多聚甲醛灌注取材，取出L5左側(cè)DRG組織，甲醛固定后行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（厚度6 μm），每例隨機(jī)取4張切片行免疫組化分析。主要步驟包括：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）3%雙氧水封閉15 min；（3）微波修復(fù)抗原后以1.5%兔封閉血清37℃下孵育30 min；（4）兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體（1:100，Santa Cruz，美國(guó)）4℃ 下孵育過(guò)夜；（5）生物素化羊抗兔IgG抗體37℃孵育20 min。DAB溶液光鏡下控制顯色10 min，蘇木素輕度復(fù)染。漂洗后脫水、透明，中性樹(shù)脂封片，在Olympus IX 70顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)恒定面積內(nèi)（×400，取5個(gè)視野）TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)同一實(shí)驗(yàn)組中的行為學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)不同組之間的比較采用Mann-Whitney U-test。不同組間免疫組化染色分析結(jié)果運(yùn)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-NP組尾椎椎間盤(pán)退變的評(píng)估結(jié)果

與上下椎間隙及SC組相比，P-NP組行纖維環(huán)穿刺后兩周，MRI顯示在T2加權(quán)像上穿刺椎間盤(pán)信號(hào)強(qiáng)度顯著降低（圖1），表現(xiàn)為“黑盤(pán)征”，提示椎間盤(pán)退變的發(fā)生。組織學(xué)觀察示穿刺椎間盤(pán)纖維環(huán)組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分切面可見(jiàn)穿刺針道，裂隙呈向心性排列。髓核組織面積較NC組（圖2A）及SC組（圖2B）明顯縮小，一般為對(duì)照組髓核的一半左右；細(xì)胞數(shù)目減少，基質(zhì)略有淡染（圖2C），提示P-NP組纖維環(huán)穿刺后尾椎椎間盤(pán)存在明顯退變過(guò)程。

2.2 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

所有手術(shù)組大鼠在術(shù)后1天均恢復(fù)了正常的運(yùn)動(dòng)功能，未見(jiàn)明顯異常步態(tài)或癱瘓的發(fā)生。機(jī)械刺激閾值結(jié)果（圖3）顯示：NC組和SC組動(dòng)物未出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象；而N-NP組和P-NP組大鼠手術(shù)側(cè)（同側(cè)）后肢機(jī)械刺激閾值均明顯降低，且這種痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象一直持續(xù)到術(shù)后第10～14天逐漸消失（圖3A）。同時(shí)，通過(guò)對(duì)術(shù)后某一時(shí)間點(diǎn)的組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第1、4、7天，移植退變髓核的P-NP組大鼠機(jī)械性閾值比N-NP組更低（P值分別為0.038，0.021和0.038，均 ＜0.05），表明該組的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏程度更重。手術(shù)對(duì)側(cè)未見(jiàn)規(guī)律性變化（圖3B）。

圖1 大鼠尾椎MRI（T2加權(quán)像）

與機(jī)械性刺激的結(jié)果不同，術(shù)后熱刺激閾值各組均未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。僅手術(shù)側(cè)下列時(shí)間點(diǎn)熱刺激閾值與術(shù)前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A）：P-NP組：術(shù)后1天（P=0.017）；N-NP組：術(shù)后第4天（P=0.025)、第10天（P=0.042）。手術(shù)對(duì)側(cè)未見(jiàn)熱刺激閾值的明顯降低（圖4B）。

2.3 免疫組化結(jié)果

NC組和SC組切片陽(yáng)性染色很少（圖5A，5B），而N-NP組和P-NP組于術(shù)后第4、14天均觀察到DRG中TNF-α表達(dá)水平顯著升高，強(qiáng)陽(yáng)性染色主要位于神經(jīng)元胞漿，分布較均勻（圖5C，5D）；間質(zhì)細(xì)胞也有部分陽(yáng)性表現(xiàn)。對(duì)N-NP組和P-NP組進(jìn)行比較，兩組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TNF-α陽(yáng)性數(shù)目均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6，第4天P=0.252，第14天P=0.146）。

圖4 手術(shù)前后熱刺激閾值（50%縮足閾值）的變化

圖5 髓核移植術(shù)后L5左側(cè)DRG的TNF-α免疫組化結(jié)果

圖6 各組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

腰椎間盤(pán)退變及其繼發(fā)的系列病理改變是引起下腰痛（low back pain）的主要原因。在椎間盤(pán)退變的研究中，探討退變與疼痛之間的關(guān)系是一個(gè)重要的發(fā)展方向。對(duì)患者而言，真正需要解決的是疼痛問(wèn)題，而不僅僅是為了改善椎間盤(pán)的基質(zhì)成分以及恢復(fù)正常MRI信號(hào)強(qiáng)度[3]。因此，有關(guān)椎間盤(pán)退變的基礎(chǔ)研究，包括動(dòng)物模型建立、各種生物療法的療效評(píng)估等只有與疼痛相聯(lián)系時(shí)才更具實(shí)際意義。然而，人類感知疼痛的復(fù)雜性決定了難以利用動(dòng)物模型進(jìn)行精確模擬，特別是評(píng)價(jià)類似于腰痛類型的軸性疼痛（axial pain）則更加困難，缺乏量化的衡量方法[6]。目前，行為學(xué)測(cè)試手段已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理與疼痛研究領(lǐng)域[6,7]，本實(shí)驗(yàn)就是利用實(shí)驗(yàn)性椎間盤(pán)髓核突出建立神經(jīng)根性疼痛模型，通過(guò)測(cè)量模型大鼠后肢對(duì)機(jī)械與熱刺激的反應(yīng)閾值進(jìn)行神經(jīng)根性疼痛評(píng)估。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先采用針刺法建立大鼠尾椎椎間盤(pán)退變模型，以獲得退變的髓核組織。大鼠尾椎椎間盤(pán)顯露方便、操作簡(jiǎn)單且成本低，適合樣本較多的篩查實(shí)驗(yàn)選用。Lotz及Iatridis等[8,9]利用持續(xù)機(jī)械壓迫法建立尾椎椎間盤(pán)退變模型，但器械裝置復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)（一般需數(shù)個(gè)月）。采用纖維環(huán)穿刺法誘致椎間盤(pán)退變模型已在兔、山羊及猴等動(dòng)物體內(nèi)成功建立[9-12]，操作簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，是目前應(yīng)用最廣泛且效果明確的一種方法[13]。結(jié)合之前的文獻(xiàn)報(bào)道，我們?cè)诖笫笪膊孔鲂∏锌诒┞蹲甸g盤(pán)后，使用限深的21G穿刺針穿刺纖維環(huán)，2周后MR和病理學(xué)觀察均證實(shí)椎間盤(pán)已發(fā)生退變。

我們分別將正常以及退變的尾椎間盤(pán)髓核組織移植到大鼠左側(cè)腰5神經(jīng)根的DRG處，通過(guò)測(cè)量手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物后肢對(duì)機(jī)械性刺激及熱刺激的反應(yīng)閾值，對(duì)比分析了該模型中神經(jīng)根性疼痛的發(fā)生過(guò)程。事實(shí)上，Olmarker、Hou等[14,15]報(bào)道了利用大鼠實(shí)驗(yàn)性髓核突出/壓迫模型評(píng)價(jià)其所致的神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究，但移植物均為正常自體或異體椎間盤(pán)組織。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，N-NP組和P-NP組移植的椎間盤(pán)組織均可引起術(shù)后同側(cè)肢體機(jī)械性刺激閾值明顯下降，即發(fā)生了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象；該現(xiàn)象在術(shù)后第一天即達(dá)到峰值，以后逐漸緩慢恢復(fù)，持續(xù)至術(shù)后2周左右。值得注意的是，術(shù)后第1、4、7天，P-NP組大鼠術(shù)側(cè)下肢機(jī)械刺激閾值比N-NP組為低，表明退變椎間盤(pán)組織所致的疼痛程度更嚴(yán)重。

有關(guān)腰椎間盤(pán)髓核突出引起神經(jīng)根性疼痛的確切原因目前尚未完全清楚。自從1934年Mixter和Barr[16]首次應(yīng)用椎間盤(pán)摘除術(shù)治療腰椎間盤(pán)突出癥以來(lái)，經(jīng)典理論一直認(rèn)為神經(jīng)根受機(jī)械壓迫是引起癥狀的主要原因[7]。近年來(lái)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[6,14,15]，單純機(jī)械性因素并不能完全解釋疼痛的來(lái)源，多種化學(xué)介質(zhì)產(chǎn)生的炎性刺激是椎間盤(pán)源性疼痛的重要因素之一。Olmarker等[17,18]對(duì)髓核分泌的化學(xué)物質(zhì)（特別是TNF-α）在神經(jīng)根性疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)十幾年的基礎(chǔ)與臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在沒(méi)有明顯機(jī)械性壓迫發(fā)生的情況下，移植髓核或者局部單獨(dú)應(yīng)用一定濃度的 TNF-α（5 ng/μL）亦會(huì)引起神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降、軸突及髓鞘損傷、神經(jīng)元凋亡增加以及機(jī)械刺激和熱刺激閾值改變等；應(yīng)用TNF-α拮抗劑對(duì)這些改變有一定的緩解作用。在本研究建立的模型中，我們?cè)陲@微鏡下行腰5左側(cè)半椎板及小關(guān)節(jié)切除、顯露神經(jīng)根起始部之后，將獲得的尾椎椎間盤(pán)髓核組織小心放置于神經(jīng)根處。雖然不能完全排除術(shù)后機(jī)械性壓迫的因素，但由于髓核是一種膠凍樣的柔軟組織，粘附于神經(jīng)表面；且手術(shù)切除周?chē)切越M織消減了機(jī)械性壓迫對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因此我們認(rèn)為，該模型中髓核釋放的化學(xué)性物質(zhì)對(duì)神經(jīng)根的炎性刺激在誘發(fā)疼痛癥狀的過(guò)程中起到了主要作用。

本研究對(duì)N-NP組與P-NP組機(jī)械性刺激閾值的比較結(jié)果表明，與正常椎間盤(pán)相比，退變椎間盤(pán)髓核移植在一段時(shí)間內(nèi)使大鼠疼痛癥狀明顯加重。根據(jù)這一結(jié)果，我們有理由推測(cè)，在椎間盤(pán)的退變進(jìn)程中，至少在某一階段，某些與疼痛有關(guān)的化學(xué)介質(zhì)得到了釋放或增加。Ulrich等[19]最近的研究發(fā)現(xiàn)，損傷大鼠尾椎纖維環(huán)后，椎間盤(pán)中與疼痛發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子——TNF-α、IL-1β和IL-8含量增高；Weiler等[20]對(duì)人體椎間盤(pán)標(biāo)本研究的結(jié)果證實(shí)，隨著椎間盤(pán)退變的加重，TNF-α的表達(dá)也隨之增加；Burke等[21]對(duì)20例因椎間盤(pán)源性疼痛而行前路融合的椎間盤(pán)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，標(biāo)本中IL-6和IL-8含量顯著升高。由此可以推斷，本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠尾椎椎間盤(pán)纖維環(huán)穿刺引起的退變過(guò)程中伴有炎性致痛介質(zhì)增高，進(jìn)而引起與疼痛有關(guān)的行為學(xué)改變；如果采用特定的治療手段（如生長(zhǎng)因子療法、基因治療等）以減輕或逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變進(jìn)程，則有可能達(dá)到緩解疼痛癥狀的目的。我們建立的退變—疼痛模型有可能成為將來(lái)評(píng)價(jià)椎間盤(pán)退變生物治療效果的理想選擇之一。

通過(guò)對(duì)髓核移植術(shù)后大鼠DRG中TNF-α表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，正常和退變髓核組織移植均可引起DRG中TNF-α顯著升高，提示神經(jīng)根性疼痛的存在；但與機(jī)械性刺激閾值結(jié)果的不同是，兩組TNF-α的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。推測(cè)可能存在兩個(gè)原因：（1）除了TNF-α以外，還有其他多種炎癥細(xì)胞因子在椎間盤(pán)源性疼痛機(jī)制中發(fā)揮作用；（2）免疫組化研究屬不精確的定量分析，如采用ELISA等精確定量手段可能有助于細(xì)微差異的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)利用大鼠尾椎椎間盤(pán)纖維環(huán)穿刺的方法建立了椎間盤(pán)退變模型，對(duì)比分析了正常與退變性髓核突出導(dǎo)致神經(jīng)根性疼痛的行為學(xué)測(cè)試結(jié)果以及DRG中TNF-α的免疫組化結(jié)果，從而為揭示椎間盤(pán)退變過(guò)程中炎癥因子釋放在疼痛發(fā)生機(jī)制中的重要作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍存在一定的局限和不足，主要包括：（1）利用纖維環(huán)穿刺建立的大鼠尾椎椎間盤(pán)退變模型與人類椎間盤(pán)退變的生理進(jìn)程有較大差異，尤其表現(xiàn)在椎間盤(pán)生物力學(xué)、形態(tài)大小等方面。（2）未對(duì)移植髓核組織中各種炎性因子的含量進(jìn)行精確定量，因而無(wú)法判斷是何種物質(zhì)在神經(jīng)根性疼痛機(jī)制中起主要作用。（3）需進(jìn)一步完善椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型，使之更符合退變引起腰腿痛的臨床實(shí)際。

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