張曉東，劉懷然，劉培欣，劉勝旺，孔憲剛

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型癥狀的，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病。ND目前在世界范圍內(nèi)許多國家都有流行，對養(yǎng)禽業(yè)造成極大的威脅[1]。NDV為副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬成員[2]。根據(jù)各病毒株對雞的致病性存在較大差異。弱毒株被用作為疫苗株防制ND。其中La Sota株是應(yīng)用最廣泛的一株。

無論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，首先都需要對新城疫病毒進(jìn)行純化。然而與ND強毒株相比，弱毒株較難在雞胚成纖維細(xì)胞上(CEF)進(jìn)行蝕斑純化。因此，在蝕斑方法的基礎(chǔ)上[3-4]，我們設(shè)計了另一種稱為cytopathogen assay的方法，對La Sota株NDV進(jìn)行純化，該方法的獨特之處是挑取細(xì)胞的病變區(qū)，從而獲得了3個病毒克隆株Clone 1、Clone 4、Clone 22。通常一個病毒克隆株來源于一個病毒粒子，所以該病毒克隆株的性質(zhì)是高度均一的。本研究中，通過血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗，病毒復(fù)制動力學(xué)試驗和免疫原性試驗，對3個克隆株進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，各個克隆株間在3種主要的生物學(xué)特性方面存在著不同程度的差異。

1 材料和方法

1.1 病毒株及SPF雞胚 NDV La Sota株由本研究室保存；SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。CEF通過胰酶消化10日齡SPF雞胚制備。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；ExTaq、PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司；M-MuLV購自MBI公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司。

1.3 Cytopathogen assay 該方法是挑取的細(xì)胞病變區(qū)。將挑取的含有感染細(xì)胞的一小塊瓊脂放入盛有1 mL培養(yǎng)液的2 mL凍存管中。

1.4 3個病毒克隆株的F基因鑒定與序列分析 經(jīng)過3次反復(fù)凍融后，將含有病毒的培養(yǎng)液接種到10日齡SPF雞胚的尿囊腔中。37℃孵育5 d后，收取尿囊液并測定血凝活性。用TRIzol提取總RNA，以上游引物P1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再用P1/P2擴增含F(xiàn)基因47 nt～420 nt的核苷酸片段,PCR擴增產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行序列測定。上游P1(4358～4377)：5'-GCC ATTGCTAAATACAATCC-3'；下游P2(5217～5197)： 5'-GGCCCGAATACTGTAGTCAAT-3'。 使 用MegAlign(DNAStar)中的Clustal W方法進(jìn)行3個病毒克隆株序列的同源性分析。

1.5 血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗 參考文獻(xiàn)[5]和[6]的方法進(jìn)行。簡而言之，將上述含病毒的尿囊液以100 r/min離心10 min,取上清液0.5 mL分裝于小管中，分別置56℃水浴2 min、4 min、6 min、9 min、11 min后立即冷卻,測定經(jīng)過處理后的HA活性。不凝集者證明血凝素消失。

1.6 病毒的復(fù)制動力學(xué)研究 按4.0 log EID50/枚的劑量接種10日齡SPF雞胚尿囊腔。在接種后24 h、48 h、72 h及96 h取樣，每個時間點隨機抽取6枚胚，收集尿囊液，混勻后分別測定其EID50。

1.7 病毒克隆株的免疫原性評估 40只SPF雞平均分配飼養(yǎng)于4個負(fù)壓隔離器中。以106EID50/0.1 mL劑量將Clone 1、Clone 4、Clone 223個病毒克隆株經(jīng)滴鼻、點眼的途徑分別接種10只SPF雞。并設(shè)有一個對照組，僅接種0.1 mL的PBS。免疫后5 d、10 d、13 d、19 d、28 d、36 d和49 d翅靜脈采血分離血清，按文獻(xiàn)[7]方法檢測NDV特異性HI抗體。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS Version 11.5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用卡方檢驗血凝素?zé)岱€(wěn)定性的結(jié)果；方差分析病毒復(fù)制動力學(xué)和抗體滴度的結(jié)果，具體采用One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 核酸序列比對分析和血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗結(jié)果 3個病毒克隆株在所擴增區(qū)域內(nèi)的同源性為100%；其血凝素?zé)岱€(wěn)定性均小于11 min(表1)。表明3個克隆均不耐熱。然而，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，Clone 22的熱穩(wěn)定性要顯著高于其它兩組(p<0.05)。而Clone 1和Clone 4之間沒有顯著的差異(p>0.05)。

表1 3個克隆株病毒的血凝素?zé)岱€(wěn)定性比較Table 1 Comparison of hemagglutinin thermostability of three virus clones(cytopathogen 1,4,22)

2.2 3個克隆株病毒在雞胚內(nèi)的復(fù)制動力學(xué)比較3個克隆株病毒的生長特性見圖1。病毒的生長滴度都在接種后72 h達(dá)到峰值，隨著培養(yǎng)時間的增加，均有略微的下降。Clone 1，4和22的最高生長滴度分別為9.71 log EID50/mL，9.88 log EID50/mL和9.71 log EID50/mL。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析處理后，3者在雞胚內(nèi)的生長特性無顯著差異(p>0.05)。

2.3 3個病毒克隆株在SPF雞體內(nèi)誘導(dǎo)抗體能力的差異分析 在大部分的時間內(nèi)，3個克隆株病毒誘導(dǎo)的抗體滴度沒有顯著差異(表2)。除了免疫后的第49 d，Clone 1和Clone 4在整個監(jiān)測期間內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力無顯著差異。Clone 22誘導(dǎo)的抗體滴度在免疫后第28 d達(dá)到峰值，與Clone 1和Clone 4相比推遲了15 d。免疫后的第5 d、13 d、49 d，3個病毒克隆株間存在著顯著的差異。但是，Clone 4卻始終保持著相對較高的滴度。這些結(jié)果表明Clone 4誘導(dǎo)的抗體出現(xiàn)的較早且消失的較慢。

表2 3個病毒克隆株誘導(dǎo)的抗體滴度Table 2 Antibody titers to La Sota strain of NDV as determined by HI assay

3 討論

Cytopathogen assay和Plaque assay是非常相似的兩種試驗方法，只是挑取的對象不同而已。鑒于新城疫弱毒株在CEF上較難形成蝕斑，卻能出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，cytopathogen assay更適合這類病毒的純化。F基因47 nt～435 nt是重要的功能域，常被用作分型的分子依據(jù)[8]。3者的同源性為100%也恰恰證明了cytopathogen assay的可靠性，同時也表明本研究所用La Sota株F蛋白裂解位點處核苷酸序列完全符合NDV弱毒株的序列特征。鑒于NDV具有RNA病毒的準(zhǔn)種特性[9]，所以在3株病毒克隆株的全基因組上可能存在著一定的差異，這些差異和其生物學(xué)特性的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗顯示，與另兩個病毒克隆株相比，Clone 22有著顯著較高的熱穩(wěn)定性。然而，畢竟它們的熱穩(wěn)定性均<11 min，所以也都屬于熱敏感型。但當(dāng)我們使用4000 r/min和8000 r/min離心10 min時，4000 r/min離心獲得的結(jié)果與100 g離心的結(jié)果非常相似。然而，8000 r/min離心時，熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示，3者間的差異則很小。這表明Clone 22的尿囊液中可能存在某種物質(zhì)有助于Clone 22株耐熱性的提高。同時表明La Sota株的這個生物學(xué)特性非常穩(wěn)定，如果不經(jīng)過特殊處理篩選，是不會輕易改變的。

本研究中，3個病毒克隆在雞胚內(nèi)的復(fù)制動力學(xué)沒有顯著的差異。然而，有一點值得注意，如果病毒在雞胚中繼續(xù)傳代，放大效應(yīng)就會產(chǎn)生，所以種毒在多次傳代后，應(yīng)定期進(jìn)行檢測，以便挑選生長特性較好的病毒克隆株。免疫原性分析結(jié)果顯示3個克隆病毒在這個生物學(xué)特性上存在著一定的差異。免疫后5 d，Clone 22誘導(dǎo)的抗體滴度顯著低于Clone 4；免疫后13 d，Clone 22的抗體滴度顯著低于Clone 1和Clone 4；免疫后49 d，Clone 1的抗體滴度顯著低于Clone 4和Clone 22的(p<0.05)。然而在大多數(shù)時間內(nèi)，3個克隆病毒所誘導(dǎo)的抗體滴度并不存在顯著差異。

本研究結(jié)果提示雖然克隆株都源自于同一個毒株，卻來自于不同的親本病毒粒子，所以不同的克隆之間在生物學(xué)特性方面會存在著微弱甚至可能顯著的差異。盡管絕大多數(shù)的病毒克隆之間不存在顯著的差異，而個別克隆株的某種生物學(xué)特性上與絕大多數(shù)克隆株間卻會存在著顯著的差異，畢竟NDV具有準(zhǔn)種的特性。本研究還表明，如果實驗采用的是野毒或新分離到的病毒，為獲得性質(zhì)均一、穩(wěn)定的病毒，純化工作是非常必要的。

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