李玉玲，王紅寧，曾瑜虹，陽(yáng) 泰，郭自成

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610064)

禽傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由IB病毒(IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的病毒性傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。IB的控制主要依賴于疫苗的預(yù)防接種，滅活疫苗成本高，弱毒疫苗存在重組和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。IBV主要通過呼吸道黏膜途徑感染機(jī)體，因此在局部建立有效的黏膜免疫應(yīng)答對(duì)于IB的控制有著重要的意義。減毒沙門氏菌X4550株是已注冊(cè)認(rèn)可的可用于口服的商用疫苗菌株，該菌株不含抗生素抗性基因，可以通過口服、滴鼻途徑免疫，直接攜帶重組質(zhì)粒進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白[2]，對(duì)呼吸道黏膜免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫和攻毒保護(hù)有增強(qiáng)作用。口服途徑接種，適用于規(guī)模化養(yǎng)殖的群體免疫[3]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，IBV3基因(S1基因、M基因、N基因)混合疫苗的免疫效果優(yōu)于單基因免疫的效果[4]。本研究聯(lián)合運(yùn)用攜帶有IBV S1、M、N基因的pVAX1-S1，pVAX1-M，pVAX1-N重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550株，構(gòu)建IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M和X4550/pVAX1-N)，用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株體外表達(dá)，經(jīng)口服免疫SPF雞，測(cè)定體內(nèi)組織分布及穩(wěn)定性、特異性IgG、IgA、CD4+和CD8+T細(xì)胞含量并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。以期為研制IBV基因減毒沙門氏菌疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒、疫苗、細(xì)菌株和雞胚 IBV SAIBk株(DQ288927)、重組質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；IBV M41株、IBV陽(yáng)性血清、陰性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞IBV高免血清為本實(shí)驗(yàn)室制備；IBV H120減毒苗購(gòu)自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司；減毒沙門氏菌X4550株由美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)生物設(shè)計(jì)中心Roy Curtiss教授惠贈(zèng)；SPF雞胚購(gòu)自北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；雞IgA ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Adlitteram Diagnostic Laboratories，Inc.；FITC 標(biāo) 記 的 CD4+、PE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞單克隆抗體(MAb)購(gòu)自美國(guó)Southern Biotechnology；FITC標(biāo)記兔抗雞IgG熒光抗體購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記兔抗雞IgG酶標(biāo)抗體購(gòu)自武漢晶美生物工程有限公司。

1.2 IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株構(gòu)建、鑒定及制備 按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》具體操作程序，用CaCl2法制備沙門氏菌X4550感受態(tài)細(xì)胞。分別將重組質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N及空質(zhì)粒pVAX1轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550感受態(tài)，構(gòu)建IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗(X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M、X4550/pVAX1-N)以及X4550/pVAX1。菌落PCR鑒定，酶切分析。

將含有 X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M和X4550/pVAX1-N的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，用滅菌的 PBS，調(diào)整細(xì)菌濃度至 109cfu/mL，即OD600nm=0.6～0.8，按 1∶1∶1體積比將這 3種菌液混勻，作為動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)的3個(gè)基因混合疫苗。

1.3 pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N真核質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 3種重組真核質(zhì)粒經(jīng)純化后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，采用IFA方法檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，一抗為雞IBV高免血清，二抗為FITC標(biāo)記兔抗雞IgG熒光抗體。

1.4 免疫雞及分組 將7日齡SPF雛雞隨機(jī)分成5組，每組30只雞。7日齡為首免，兩周后加強(qiáng)免疫一次，免疫前實(shí)驗(yàn)雞禁水禁食4 h。

表1 免疫雞分組Table 1 Experimental design

1.5 重組菌X4550/pVAX1-GFP的構(gòu)建、組織分布及穩(wěn)定性測(cè)定 將構(gòu)建的重組菌X4550/pVAX1-GFP的濃度配制為109cfu，取15只7日齡SPF雛雞，每只雞喂食1 mL，分別于喂食后3 d、6 d、9 d各迫殺2只雞，取心、肝、脾、肺、腎、睪丸(卵巢)、小腸7個(gè)組織，制備成冰凍切片，在熒光顯微鏡下迅速觀察X4550/pVAX1-GFP在這7個(gè)組織的分布情況。

將 3種重組菌按 1∶1∶1(體積比)混勻，取 10只7日齡SPF雛雞，口服接種3種重組菌的混合疫苗，免疫后6周隨機(jī)迫殺4只雞，取肺組織和腎臟，用PBS液制備組織勻漿，涂板培養(yǎng)后，做S1、M、N基因菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.6 特異性IgG測(cè)定 應(yīng)用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法純化IBV，包被ELISA酶標(biāo)板。首免后2周及6周，每組隨機(jī)選取5只雞，翅靜脈采血，室溫靜置，分離血清，采用間接ELISA法檢測(cè)特異性IBV血清抗體，同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照，二抗為HRP標(biāo)記兔抗雞IgG酶標(biāo)抗體。

1.7 腸道黏膜IgA測(cè)定 首免后6周，每組隨機(jī)迫殺5只雞，按文獻(xiàn)[5]方法采集并制備小腸粘膜樣品，固相夾心ELISA測(cè)定腸道黏膜IgA濃度。具體步驟參照雞免疫球蛋白A(IgA)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書。

1.8 淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+T檢測(cè) 首免后2周及6周，每組隨機(jī)選取5只雞，翅靜脈采集全血，密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD4+T細(xì)胞，PE標(biāo)記CD8+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞亞類含量，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

1.9 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 首免后6周IBV M41104EID50，0.2 mL/羽，滴鼻和點(diǎn)眼(各一半)攻毒，每組15只雞。觀察雞只有無(wú)不良反應(yīng)和死亡情況，當(dāng)日迫殺有癥狀及死亡雞只，無(wú)菌采集有癥狀雞只氣管及肺組織制備勻漿，從氣管、肺組織勻漿上清液中提取RNA，做S1、M、N基因RT-PCR，記錄病毒的分離情況；觀察死亡雞只組織病變，確定死因。攻毒后第5 d及第10 d每組迫殺5只雞，第15 d迫殺全部存活無(wú)癥狀雞只，分離病毒，方法同上。死亡雞和迫殺雞病毒檢出陽(yáng)性的為未保護(hù)，迫殺和存活雞只病毒檢出陰性者判定為受保護(hù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PRISM軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異設(shè)為p<0.05。

2 結(jié)果

2.1 IBV S1、M、N基因重組沙門氏菌疫苗構(gòu)建鑒定結(jié)果 如圖1顯示，可擴(kuò)增出和預(yù)期目的基因大小相符的片段以及質(zhì)粒pVAX1片段，表明IBV S1、M、N基因已被正確插入到真核表達(dá)載體pVAX1，并成功轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550中。

2.2 pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N真核質(zhì)粒的體外表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 在藍(lán)光激發(fā)下，轉(zhuǎn)染了pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N真核質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞，顯示出特異性黃綠色熒光，而轉(zhuǎn)染了pVAX1的細(xì)胞沒有顯示出任何特異熒光，表明IBV SAIBk株S1、M、N蛋白在COS-7細(xì)胞中均獲得表達(dá)(圖 2)。

2.3 重組菌X4550/pVAX1-GFP的組織分布及穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)雞腸、脾、肝、心、腎、肺6個(gè)組織，在熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，生殖器官睪丸(卵巢)未觀察到GFP的表達(dá)(圖 3)。

重組菌接種后6周，從肺和腎臟進(jìn)行細(xì)菌分離，并進(jìn)行S1、M、N基因的菌落PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明分離菌中均能擴(kuò)增出與3個(gè)基因大小相符的DNA片段。

2.4 抗IBV特異性IgG檢測(cè)結(jié)果 首免后2周，X4550/pVAX1-S1/M/N組即可刺激實(shí)驗(yàn)雞產(chǎn)生IBV特異性IgG抗體，OD值高于PBS組(p<0.01)和 X4550/pVAX1組(p<0.05)， 但 低 于 H120組(p<0.05)。二免后4周，X4550/pVAX1-S1/M/N組和H120組OD值繼續(xù)升高，pVAX1-S1/M/N組OD值呈下降趨勢(shì)且和PBS組比較已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)(圖4)。

2.5 腸道黏膜IgA檢測(cè)結(jié)果 首免后6周，經(jīng)黏膜途徑接種的X4550/pVAX1-S1/M/N組(口服)和H120組(滴鼻)，均能誘發(fā)極高的黏膜IgA濃度，顯著高于 PBS組和 X4550/pVAX1組(p<0.01)；pVAX1-S1/M/N組不能刺激局部IgA濃度的升高(圖5)。

2.6 淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+T檢測(cè)結(jié)果 X4550/pVAX1-S1/M/N組的CD4+T淋巴細(xì)胞含量，僅需免疫一次，其水平就明顯上升，首免后2周，顯著高于PBS組(p<0.01)，加強(qiáng)免疫后，含量繼續(xù)升高，二免后4周顯著高于PBS組、pVAX1-S1/M/N組及X4550/pVAX1組(p<0.01)。H120組動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與X4550/pVAX1-S1/M/N組完全相同。接種X4550/pVAX1-S1/M/N組疫苗可以刺激CD8+T細(xì)胞含量逐漸升高，二免后4周顯著高于PBS組、pVAX1-S1/M/N組及X4550/pVAX1組(p<0.01)。H120組CD8+T淋巴細(xì)胞含量始終穩(wěn)定在較高水平，和PBS組比較差異顯著(p<0.01)，但與X4550/pVAX1-S1/M/N組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)(圖6)。

2.7 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將各次檢測(cè)結(jié)果相加，H120組攻毒保護(hù)(12/15只雞)，X4550/pVAX1-S1/M/N組攻毒保護(hù)(11/15只雞)和pVAX1-S1/M/N組攻毒保護(hù)(10/15只雞)，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，顯著高于 PBS組和 X4550/pVAX1組(p<0.01)(表2)。表明X4550/pVAX1-S1/M/N疫苗具有免疫保護(hù)作用。

表2 IBV M41株攻毒后，各組保護(hù)效果比較Table 2 Protection rate of different groups challenged by IBV M41 strain

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株可致腸道黏膜IgA顯著升高。減毒沙門氏菌可將重組質(zhì)粒直接運(yùn)送給APC并在其內(nèi)表達(dá)，可刺激強(qiáng)烈的原位黏膜免疫反應(yīng)，產(chǎn)生局部IgA，通過共同的黏膜免疫系統(tǒng),還可致遠(yuǎn)處的黏膜表面(如呼吸道、口腔、生道、淚腺)誘發(fā)較強(qiáng)的黏膜免疫，形成抵抗病原侵入的第一道屏障[8]。IgG是血液循環(huán)中具有中和作用的主要抗體，可阻止病毒吸附于易感靶細(xì)胞，而降低病毒的傳染性，減輕臨床癥狀[9]，本研究構(gòu)建的重組菌疫苗，接種后可致IgG滴度顯著高于PBS組及空載體組。重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株還可致CD4+、CD8+T細(xì)胞含量顯著升高，MHCⅠ限制的CD8+CTL可有效清除病毒粒子[10]；MHCⅡ限制的CD4+Th1反應(yīng)可以促使CD8+CTL的增殖、成熟和功能活化，有助于B細(xì)胞活性增加，并能直接誘導(dǎo)抗病毒的淋巴活素的產(chǎn)生[11]。細(xì)胞免疫不但可以對(duì)IBV最初的感染具有抑制作用，而且在IBV的攻毒保護(hù)中，起著重要的作用[9]。

IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗，可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)效應(yīng)器官并穩(wěn)定存在于其中；口服免疫SPF雞，腸道黏膜IgA濃度、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞顯著增多，并產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果；口服還方便了疫苗的接種。減毒沙門氏菌遞送DNA疫苗進(jìn)入機(jī)體，是否具有免疫原性，關(guān)鍵在于能否到達(dá)效應(yīng)器官，并在效應(yīng)器官穩(wěn)定存在足夠長(zhǎng)的時(shí)間[6]。本研究減毒沙門氏菌X4550組織定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除睪丸(卵巢)外，小腸、心臟、肝臟、脾臟、肺組織和腎臟6個(gè)器官均能觀察到GFP的表達(dá)，提示X4550能將重組質(zhì)粒帶至遠(yuǎn)處實(shí)質(zhì)性器官并釋放重組質(zhì)粒，目的基因開始轉(zhuǎn)錄并得到表達(dá)。本研究為研制IBV基因減毒沙門氏菌疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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