王 琪，葛金英，焦利紅，曹有才，李曉艷，馬 良，馬吉飛，王笑梅，步志高*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，天津300384；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)和新城疫(Newcastle disease，ND)為分別由IBD病毒(IBDV)和ND病毒(NDV)引起的禽類2種重大疫病。自上世紀(jì)80年代以來，歐洲及我國相繼出現(xiàn)IBDV超強(qiáng)毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)的流行[1]，該病能夠引起雞免疫機(jī)能障礙，對(duì)其他疾病的易感性增加；ND也給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，預(yù)防和控制這兩種烈性傳染病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

NDV作為一種活病毒載體具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免疫以及細(xì)胞免疫；可通過飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或肌肉注射等途徑免疫；La Sota疫苗株長期用于家禽防疫，其安全性已被充分證明。Ge等利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)H5N1禽流感HA基因重組NDV疫苗已經(jīng)上市，該疫苗顯示NDV具有作為活病毒載體疫苗應(yīng)用的潛力[2]。

雞胚免疫接種(Chicken embryo immunization)是指對(duì)一定胚齡的雞胚接種疫苗，使得雛雞出殼時(shí)至出殼后幾天內(nèi)具有特異性主動(dòng)免疫力，該方法能夠有效降低生產(chǎn)成本，具有產(chǎn)生免疫早、應(yīng)激反應(yīng)低、污染少等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。研究表明通過胚胎免疫來預(yù)防ND[5]和IBD[6]是安全有效的。

本研究選用表達(dá)vvIBDV VP2基因的重組NDV(rL-VP2)，用不同劑量對(duì)18胚齡SPF雞胚進(jìn)行免疫，確定該疫苗用于胚胎免疫的最佳免疫劑量，并對(duì)免疫后的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)估，為該重組二聯(lián)活載體疫苗的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、雞胚和雛雞 rL-VP2疫苗株由哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病研究室研制并保存；NDV強(qiáng)毒F48E9株和vvIBDV Gx株由哈爾濱獸醫(yī)研究所菌毒種保藏中心提供；NDV抗原由本實(shí)驗(yàn)室保存；9胚齡和18胚齡SPF雞胚、1日齡和6周齡SPF雞雛均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 IBDV抗體檢測(cè)試劑盒購自IDEXX公司；胚胎免疫針頭購自Tyco/Healthcare公司；孵化器和負(fù)壓隔離器為Nature Form公司產(chǎn)品。

1.3 rL-VP2半數(shù)雞胚感染量(EID50)和平均雞胚致死時(shí)間(MDT)測(cè)定 將rL-VP2做適當(dāng)稀釋，按OIE推薦方法接種雞胚，重復(fù)4次。按Reed-Muench法計(jì)算EID50；計(jì)算平均致死時(shí)間，按以下時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)判定毒力強(qiáng)弱：速發(fā)型(急性，強(qiáng)毒)MDT≤60 h，中發(fā)型(亞急性，中等毒力)MDT為61 h～90 h，緩發(fā)型(低毒力)MDT>90 h。

1.4 rL-VP2腦內(nèi)接種指數(shù)(ICPI)和靜脈內(nèi)致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定 測(cè)定方法參照OIE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 試驗(yàn)分組及雞胚免疫接種 將18胚齡健康SPF雞胚隨機(jī)分為8組，每組35枚。1組～7組接種rL-VP2，劑量分別為106EID50/枚、105EID50/枚、104.7EID50/枚、104EID50/枚、103.7EID50/枚、103EID50/枚和102EID50/枚，第8組接種等量無菌PBS。在相同的條件下孵化，出殼后，將各組雞雛隔離飼養(yǎng)。出殼后第9 d、第14 d和第21 d由各組中隨機(jī)選取10只雛雞經(jīng)翼靜脈采血，檢測(cè)抗NDV抗體和抗IBDV抗體水平。

1.6 血清中抗NDV抗體和抗IBDV抗體測(cè)定 采用微量凝集法[7]測(cè)定血清中抗NDV抗體HI滴度；按IDEXX公司IBDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行血清中抗IBDV抗體的檢測(cè)。

1.7 攻毒試驗(yàn) 出雛28 d后，選擇免疫后出雛率、存活率及抗體水平較理想的第4組的20只雛雞，隨機(jī)分為2組，其中，一組用NDV強(qiáng)毒F48E9株以105EID50/只劑量經(jīng)肌肉注射途徑攻毒，同時(shí)選取PBS接種組雛雞10只，以相同的劑量和途徑攻毒作為對(duì)照，觀察2周，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率；另一組用vvIBDV Gx株以105EID50/只的劑量經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑攻毒，隨機(jī)選取10只經(jīng)PBS接種的雛雞，以相同的劑量和免疫途徑攻毒，觀察8 d后，對(duì)存活雞進(jìn)行剖檢，測(cè)定法氏囊囊指數(shù)(BBIX)。

2 結(jié)果

2.1 rL-VP2致病性試驗(yàn)結(jié)果 rL-VP2EID50為10-8.74±0.11/0.1 mL，MDT 為 132.3±0.65 h，ICPI和IVPI結(jié)果均為0，表明rL-VP2為溫和型病毒，可用于胚胎免疫試驗(yàn)。

2.2 免疫劑量對(duì)出雛率和存活率的影響 按不同劑量進(jìn)行胚胎免疫，3 d后出雛，棄掉弱雛后統(tǒng)計(jì)出雛率，剩余的健康雛雞進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，21 d后統(tǒng)計(jì)存活率(表1)。結(jié)果表明：高劑量免疫組(第1、2、3組)的出雛率明顯低于低劑量組(第5組、6組)和對(duì)照組(第8組)；高劑量免疫組的存活率也明顯低于低劑量免疫組。另外，104EID50/枚劑量免疫組(第4組)的出雛率和存活率分別為91.4%和93.8%。

2.3 血清中抗NDV抗體水平檢測(cè) 分別于出雛后第9 d、第14 d和第21 d，由每組隨機(jī)選擇10只雛雞采血，檢測(cè)血清中抗NDV抗體的HI滴度(表2)。結(jié)果表明：各免疫組在出雛后第9 d能夠檢測(cè)到抗NDV特異性抗體，其中第3組、第4組在第14 d和第21 d的HI滴度均超過5log2。

表1 rL-VP2免疫后對(duì)出雛率及3周存活率Table 1 Effect ofin ovovaccination of rL-VP2 on hatchability and 3rd week survivability of hatched chickens

表2 rL-VP2免疫后各組抗NDV抗體效價(jià)Table 2 The titeration of HI antibody against NDV in chickens vaccinated with rL-VP2

2.4 血清中抗IBDV抗體水平檢測(cè) 采用IDEXX公司IBDV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出雛后第9 d、第14 d和第21 d各組雛雞血清中抗IBDV抗體水平(圖1)。結(jié)果表明：不同劑量免疫組出殼后第9 d均能產(chǎn)生抗IBDV抗體，并且第21 d達(dá)到較高水平；高劑量免疫組(第1組～第4組)抗IBDV抗體水平明顯高于低劑量免疫組(第5組～第7組)。

2.5 rL-VP2胚胎免疫后的攻毒保護(hù)效果 出雛28 d后，分別用NDV強(qiáng)毒F48E9株和vvIBDV Gx株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)(表3)。結(jié)果表明：rL-VP2免疫組(104EID50/胚)可同時(shí)抵抗F48E9株和Gx株的攻擊，雛雞未出現(xiàn)臨床癥狀，存活率均達(dá)到100%(10/10)；而用F48E9株攻擊PBS對(duì)照組，雛雞全部發(fā)病死亡，存活率為0(0/10)；Gx株攻擊PBS對(duì)照組全部發(fā)病，存活率為40%(4/10)；攻毒試驗(yàn)組的第2組和第4組存活雞體重分別為198.45 g±54.59 g和158.10 g±28.31 g；BBIX分別為0.96±0.09和0.26±0.12。剖檢變化顯示：第4組法氏囊嚴(yán)重變形及萎縮，而第2組存活雞的法氏囊無肉眼可見病變(圖片未顯示)。以上結(jié)果表明：rL-VP2按104EID50/胚的劑量進(jìn)行胚胎免疫具有良好的安全性和效力，免疫后雞雛能夠?qū)DV強(qiáng)毒和vvIBDV的攻擊產(chǎn)生100%的保護(hù)率。

表3 免疫雞對(duì)F48E9株和Gx株的攻擊保護(hù)效果Table 3 Protections of chickens after challenging with F48E9strain and Gx strain

3 討論

VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白、宿主保護(hù)性抗原以及病毒衣殼的主要成分，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)與識(shí)別有關(guān)[8]。長期以來，各國學(xué)者研制表達(dá)VP2抗原重組禽腺病毒、重組火雞皰疹病毒和重組禽痘病毒[9-11]等活載體疫苗相繼取得成功，但由于上述表達(dá)系統(tǒng)存在諸多不足，均未應(yīng)用于生產(chǎn)中。

從雞胚免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程分析，當(dāng)雞胚發(fā)育到17胚齡～18胚齡時(shí)，其法氏囊結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)育完善，免疫系統(tǒng)已基本建立，能夠?qū)δ承┛乖a(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答[12]。與出雛后免疫相比，18胚齡時(shí)進(jìn)行胚胎免疫能夠誘導(dǎo)機(jī)體更早地出現(xiàn)滴度更高的抗體[5]。目前，已證實(shí)用該方法預(yù)防馬立克氏病、ND、傳染性支氣管炎、IBD和一些細(xì)菌、寄生蟲引起的疾病是安全、有效的[4]。在胚胎免疫中，最佳免疫劑量的選擇對(duì)雞胚的出雛率、存活率和免疫后抗體水平均有較大影響[13-14]。

本研究應(yīng)用不同劑量rL-VP2接種18胚齡SPF雞胚，結(jié)果顯示104EID50/枚免疫組的出雛率、存活率及免疫后抗體水平均比其他免疫組理想；免疫保護(hù)效果顯示，該免疫組在出雛28 d時(shí)能夠同時(shí)對(duì)NDV強(qiáng)毒和IBDV強(qiáng)毒致死劑量的攻擊產(chǎn)生免疫保護(hù)作用(存活率達(dá) 100%)。由此可以推斷，用rL-VP2按104EID50/枚劑量進(jìn)行胚胎免疫是安全和有效的，rL-VP2有望作為預(yù)防ND和IBD的雞胚接種用疫苗進(jìn)行推廣使用。

胚胎免疫接種要求低，技術(shù)難度低，并且目前已經(jīng)有自動(dòng)消毒、注射、封洞于一體的雞胚注射系統(tǒng)，在大型養(yǎng)雞場(chǎng)推廣該技術(shù)，能夠有效地降低NDV和IBDV對(duì)雞群的危害，減少傳統(tǒng)免疫方法造成的應(yīng)激反應(yīng)，節(jié)約生產(chǎn)成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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