董惠鈞，姜俊云

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微生物法制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的機(jī)制和方法

董惠鈞，姜俊云

273400 山東省臨沂，魯南制藥集團(tuán)股份有限公司

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）是含有單個(gè)唾液酸的酸性鞘糖脂，被認(rèn)為是除腦源性神經(jīng)生長因子和層粘蛋白外，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有顯著臨床療效的生物藥物。GM1主要來源于哺乳動(dòng)物含豐富神經(jīng)的腦組織，經(jīng)有機(jī)溶劑提取和柱層析分離精制獲得。由于 GM1在腦組織神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)中的含量非常少約為 32.9%[1]，提取收率低，所以要經(jīng)過多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的轉(zhuǎn)化作用生成單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。目前轉(zhuǎn)化方法主要是酸法轉(zhuǎn)化，但是酸法轉(zhuǎn)化的效率低，處理溫度高以及處理量少，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來，科研人員開發(fā)了一種利用酶促反應(yīng)水解唾液酸糖苷鍵進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化的方法，該法具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化條件溫和、處理量大等優(yōu)點(diǎn)。本文概括介紹了國內(nèi)外在神經(jīng)節(jié)苷脂、唾液酸酶和 GM1微生物酶法轉(zhuǎn)化工藝研究等方面的研究進(jìn)展，并展望了生物法制備 GM1的發(fā)展趨勢(shì)。

1 神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)性質(zhì)與功能

1.1 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglidosides，GLS）由一類含唾液酸的親水寡糖通過 β-1, 1 糖苷鍵與疏水的神經(jīng)酰胺連接而成的兩性大分子（圖1）。神經(jīng)節(jié)苷脂由鞘氨醇、脂肪酸和含唾液酸的寡糖鏈三部分組成。神經(jīng)節(jié)苷脂鞘氨醇為鏈長 18 或 20 個(gè)碳的多羥基脂肪胺；脂肪酸是通過亞氨基連結(jié)在神經(jīng)鞘氨醇基上，主要是硬脂酸（18:0）占 95%，其他 5% 的脂肪酸有蛛網(wǎng)酸（20:0）、棕櫚酸（16:0）或棕櫚油酸（16:1）。脂肪酸和鞘氨醇組成神經(jīng)酰胺（ceramide），是神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)中的疏水部分。神經(jīng)節(jié)苷脂中的寡糖鏈主要為 D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）、D-乙酰半乳糖胺（GalNAc）。寡糖鏈末端的唾液酸以乙?；问酱嬖冢Q為 N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuNAc，NANA）。寡糖鏈和唾液酸上的多羥基組成神經(jīng)節(jié)苷脂的親水部分[2-3]。因此，兩性分子神經(jīng)節(jié)苷脂是以微泡或聚合物形式溶于水。

1.2 生物學(xué)功能

神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞膜上，其中在腦組織和神經(jīng)組織中含量最高。作為膜抗原和病毒、細(xì)菌及毒素的受體，GLS 在細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞粘合，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，決定血型等方面起著非常重要的作用[4-6]。神經(jīng)節(jié)苷脂水解產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺（ceramide），是一種抑制性第二信使，參與多種細(xì)胞功能，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、變異、凋亡，調(diào)節(jié)蛋白分泌，參與免疫過程與炎癥反應(yīng)等功能[7]。其中含有一個(gè)唾液酸的 GLS 稱為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂，它能夠通過血-腦脊液屏障，聚集受損腦區(qū)嵌入細(xì)胞膜，模仿內(nèi)源性 GM1發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存、軸突生長和突觸生長的神經(jīng)重構(gòu)，恢復(fù)由于各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能，而且對(duì)損傷后繼發(fā)性神經(jīng)退化和腦水腫也有積極作用[8-11]。1996 年我國從阿根廷 TRB Pharma 公司引進(jìn)了利用豬腦生產(chǎn)的 GM1注射液，商品名為 Sygen（施捷因），用于治療顱腦損傷、神經(jīng)退化、帕金森綜合征等腦部疾病。

圖 1 神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)[12]

國內(nèi)齊魯制藥有限公司生產(chǎn)的相同規(guī)格的豬腦來源 GM1鈉注射液（商品名：申捷）于 2004 年上市，獲得了良好的臨床應(yīng)用效果。

2 唾液酸酶

2.1 唾液酸酶類型

唾液酸酶（sialidase）又稱神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase），是水解酶系中的大家族，按水解方式可分為內(nèi)切唾液酸酶（exo-α-sialidase，EC 3.2.1.18）和外切唾液酸酶（endo-α- sialidase，EC 3.2.1.129）；按照來源可分為哺乳動(dòng)物唾液酸酶（共有 Neu1、Neu2、Neu3、Neu4 4個(gè)類型）、細(xì)菌唾液酸酶和流感病毒唾液酸酶（N1 ~ N9 共 9 個(gè)亞型）。序列分析表明細(xì)菌唾液酸酶的大小從 40 到 115 kDa不等，唾液酸酶蛋白質(zhì)序列中除了兩處保守的模塊 FRIP（Phe-Arg-Ile- Pro）和 Asp box（Ser/Thr-X-Asp-[X]-Gly-X-Thr-Trp/Phe）外，其余序列并不保守。由致病菌或病毒分泌的唾液酸酶是四個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同的單體亞基組合而成的四聚體，唾液酸酶基因由基因編碼[13-15]，因物種不同長度從 1 200 ~ 1500 bp不等。Roggentin 等[16]首次從中成功克隆了唾液酸酶基因，為研究唾液酸酶的結(jié)構(gòu)和功能提供了便利。盡管微生物唾液酸酶的蛋白序列并不保守，但它們的空間結(jié)構(gòu)具有保守的典型特征（圖2），主要是 β 螺旋功能域、免疫球蛋白樣模塊和半乳糖結(jié)合功能域（卷曲構(gòu)型）[17]。需特別指出的是唾液酸酶是流感病毒的抗原決定簇之一，隨著病毒的不斷復(fù)制和變異，唾液酸酶會(huì)發(fā)生氨基酸突變，形成不同的亞型，目前發(fā)現(xiàn)有 9 個(gè)亞型。目前已知共有 70 多個(gè)物種的基因組中含有唾液酸酶基因，編碼 137 種不同類型的唾液酸酶，包括人、靈長類動(dòng)物、海洋軟體動(dòng)物、原蟲和各種微生物，其中非致病性普通微生物有糖多孢紅霉菌（）、灰色鏈霉菌（）、谷氨酸棒桿菌（）、阿維鏈霉菌（）、煙曲霉（）、禾谷鐮孢菌（）、樹干畢赤酵母（）、游海假交替單胞菌（）、煙草節(jié)桿菌（）等。有的土壤微生物綠色小單胞菌（）分泌的唾液酸酶有兩種形式，一種僅含有水解功能域，大小約為 42 kDa，另一種則含有水解功能域和半乳糖結(jié)合功能域，大小約為 68 kDa，前一種形式的唾液酸酶與流感病毒分泌的唾液酸酶相似，出現(xiàn)不同大小唾液酸酶是由不同的培養(yǎng)基中不同碳源誘導(dǎo)所致，但具體的誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)機(jī)制還不清楚[18]。

2.2 唾液酸酶功能、性質(zhì)和活性測(cè)定

在流感病毒或致病菌中，唾液酸酶能夠?qū)⒉《绢w粒表面含唾液酸的糖蛋白進(jìn)行水解，使病毒顆粒脫離宿主細(xì)胞進(jìn)行傳播和擴(kuò)散。而在一些非致病菌如土壤細(xì)菌中，唾液酸酶主要的功能則是水解唾液酸用作碳源或能源進(jìn)行物質(zhì)代謝[19]。唾液酸酶在弱酸性條件下（pH 5.0 ~ 5.5）活性最強(qiáng)，而且受多種無機(jī)離子的影響，其中鹵素離子 Cl–和 Br–能夠顯著提高唾液酸酶活性[20]，2 mmol/L 濃度的 Hg2+、Cu2+、Fe2+則會(huì)抑制唾液酸酶的活性[21]。唾液酸酶酶活定量測(cè)定有多種方法，基本原理是利用神經(jīng)氨酸衍生物作為底物，經(jīng)唾液酸酶酶解后釋放衍生部分作為待測(cè)定物質(zhì)，利用顏色反應(yīng)或熒光檢測(cè)來測(cè)定唾液酸酶活性，主要方法有 4-甲基傘形酮基法、溴吲哚基法和苯酮苷法[22-23]。Yao 等[24]則利用離子交換色譜和酸性茚三酮測(cè)定唾液酸酶活性。經(jīng)典的硫巴比妥酸法（TBA）則是測(cè)定唾液酸酶水解唾液酸衍生物后的唾液酸含量來確定，NANA 被過碘酸鈉氧化生成 β-醛基丙酮酸，繼而與硫代巴比妥酸偶聯(lián)生成紅色化合物，該化合物在 549 nm 波長下有最大吸收[25]。

圖 2 唾液酸酶蛋白結(jié)構(gòu)

3 微生物酶法轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂

3.1 轉(zhuǎn)化機(jī)制

從神經(jīng)節(jié)苷脂的糖鏈結(jié)構(gòu)上可以看出有三種水解酶可以破壞寡糖鏈，分別為神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切酶、外切半乳糖甘酶和唾液酸酶，但事實(shí)上只有唾液酸酶適用于水解神經(jīng)節(jié)苷脂，而不破壞 GM1中唾液酸。唾液酸酶負(fù)責(zé)催化唾液酸與糖酯之間糖苷鍵中酮基的水解，唾液酸酶不同于神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切酶，后者水解切割神經(jīng)酰胺與寡糖鏈間的糖苷鍵。微生物來源唾液酸酶能夠水解 α-2, 3、α-2, 6 和 α-2, 8 糖苷鍵，但對(duì) α-2, 3 糖苷鍵的水解活性高于 α-2, 6 和 α-2, 8 糖苷鍵，而且微生物唾液酸酶對(duì)于處于寡糖鏈非末端的 α-2, 3 糖苷鍵連接的唾液酸沒有水解活性[26]，利用這一特性可以將三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂水解成單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂，而 GM1則不會(huì)被脫去唾液酸（表1）。

3.2 應(yīng)用

GLS 在動(dòng)物腦組織中含量豐富，在腦灰質(zhì)中含量較高，例如豬腦和牛腦，其中豬腦 GLS的總含量為豬全腦濕重的 0.0894%，高于牛腦的 0.0536%，而且牛腦提取物容易被病毒污染，所以豬腦是理想的 GM1來源。豬腦 GLS 的主要成分有 GM1、GM2、GD1a、GD1b和 GT1b[27]。目前其生產(chǎn)工藝大多采用溶劑萃取、酸法水解轉(zhuǎn)化和柱層析等分離提取程序從腦組織中制備 GM1單體。該方法制備 GM1需要消耗大量有機(jī)溶劑，成本高，而且剩余大量的多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂無法應(yīng)用，是一種很大的浪費(fèi)。因此，利用微生物或唾液酸酶進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化能夠提高神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化效率，提高 GM1的收率。目前國內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)微生物法轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行了研究，并成功應(yīng)用于 GM1的規(guī)?；a(chǎn)中，取得了良好效果。

表 1 唾液酸酶對(duì)不同神經(jīng)節(jié)苷脂的水解位點(diǎn)和活性

表 2 酸法和微生物酶法轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂比較

華東理工大學(xué)王學(xué)東等[28-29]利用能夠分泌唾液酸酶的乳酪短桿菌（）進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂的微生物轉(zhuǎn)化，考察了 pH、溫度、轉(zhuǎn)化體積、底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明乳酪短桿菌能夠分泌特異性水解末端 α-2, 3和 α-2, 8 糖苷鍵的唾液酸酶，可將神經(jīng)節(jié)苷脂中的 GD 和 GT 組分有效地轉(zhuǎn)化為 GM1，使粗脂中 GM1的含量從 9% 提高至 45%，而且該酶并不催化水解 GM1中的唾液酸。日本學(xué)者 Fukano 和 Ito[30]從海洋微生物中篩選到一株產(chǎn)唾液酸酶的菌株 YF-2，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬（）。YF-2 菌株分泌的唾液酸酶大小為 110 kDa，也具有神經(jīng)節(jié)苷脂 GD1a、GD1b和 GT 的底物特異性，對(duì) GM1沒有水解活性。25 ℃條件下培養(yǎng) YF-2 菌株 3 d 可將 80% ~ 90% 的神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化為 GM1。除了上述已經(jīng)應(yīng)用于神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化的微生物外，綠色小單胞菌也能夠高效分泌唾液酸酶，重組綠色小單胞菌唾液酸酶蛋白產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床免疫學(xué)檢測(cè)。我們對(duì)綠色小單胞菌分泌唾液酸酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在沒有聚唾液酸或神經(jīng)氨酸誘導(dǎo)情況下，該菌也能夠高效分泌唾液酸酶，而且具有與上述研究中微生物唾液酸酶相同的水解特性，下一步我們將用家蠶絲素凝膠固定化綠色小單胞菌制備成柱式填充床反應(yīng)器對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行轉(zhuǎn)化，建立適合于工業(yè)化生產(chǎn)的 GM1微生物轉(zhuǎn)化和制備工藝，旨在提高神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化效率并實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。

相對(duì)于酸法轉(zhuǎn)化，利用微生物和唾液酸酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn) GM1具有專一性高，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)（表2），可以將多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂專一性地轉(zhuǎn)化為 GM1，提取分離后未轉(zhuǎn)化的多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂仍可用于下一批次的轉(zhuǎn)化，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的樣品中幾乎不含 GT 組分，僅含少量 GD 組分，轉(zhuǎn)化效果明顯優(yōu)于酸轉(zhuǎn)化法，并且減少了溶劑消耗。而且微生物培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程的成本低，能夠顯著提高生產(chǎn)效率，降低 GM1的生產(chǎn)成本。

4 結(jié)語與展望

盡管微生物酶法轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂生產(chǎn) GM1已經(jīng)能夠成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，但是目前發(fā)現(xiàn)的能夠分泌唾液酸酶的微生物培養(yǎng)復(fù)雜，生長周期長，唾液酸酶分泌能力有待提高，這些因素直接影響了轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂的效率。與酸法相比，微生物酶法轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂的主要缺點(diǎn)就是轉(zhuǎn)化時(shí)間長。因此，可以考慮從以下幾個(gè)方面提高轉(zhuǎn)化效率：通過對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)行誘變處理，獲得高唾液酸酶活性菌株，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間；從分泌唾液酸酶的微生物中獲取唾液酸酶編碼基因，采用適當(dāng)?shù)母弑磉_(dá)載體，在大腸桿菌或酵母菌中高效表達(dá)分泌型唾液酸酶，實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化；將固定化細(xì)胞技術(shù)和轉(zhuǎn)化分離耦合相結(jié)合，建立微生物轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂的連續(xù)生產(chǎn)系統(tǒng)，能夠在一定時(shí)期內(nèi)連續(xù)不斷的將轉(zhuǎn)化后的 GM1分離出來，從而提高轉(zhuǎn)化效率。

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董惠鈞，Email：dhjjjy@gmail.com

2009-11-02

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.012