解茹，張貴鋒，高建萍，王明林，馬潤宇，蘇志國

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溫度和pH對重組人血管內(nèi)皮抑制素脫酰胺的影響

解茹，張貴鋒，高建萍，王明林，馬潤宇，蘇志國

100029 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（解茹、馬潤宇）；100190 北京，中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張貴鋒、蘇志國）；271018 泰安，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（高建萍、王明林）

利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究溫度和 pH 對重組人血管內(nèi)皮抑制素中天冬酰胺（Asn）脫酰胺過程的影響。

在不同的溫度和 pH 值條件下，對重組人血管內(nèi)皮抑制素樣品溶液進(jìn)行孵化，酶解處理后利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)識別發(fā)生脫酰胺的多肽并測定其含量隨樣品放置溫度和 pH 條件的變化。

質(zhì)譜分析結(jié)果表明酶解產(chǎn)物中多肽 SVWHGSDPNGR序列中的 Asn 發(fā)生了脫酰胺化，Asn 殘基生成了天冬氨酸和異天冬氨酸殘基，其他位置的 Asn 均未檢測出明顯的脫酰胺化；實(shí)驗(yàn)獲得了不同溫度和 pH 條件下重組人血管內(nèi)皮抑制素中 Asn 脫酰胺化的速率及動力學(xué)常數(shù)；Asn 脫酰胺過程隨著溫度和溶液pH 值的升高，Asn 脫酰胺速率上升。

重組人血管內(nèi)皮抑制素中天冬酰胺的脫酰胺過程受儲存溫度和 pH 值影響，研究藥用蛋白質(zhì)在不同條件下的脫酰胺過程對于篩選合適的儲存條件、減少活性損失具有重要意義。

血管抑制素類； 天冬酰胺； 肽類；色譜法，高壓液相

蛋白質(zhì)中 Asn 或 Gln 殘基均可發(fā)生非酶催化的脫酰胺化，但 Gln 的脫酰胺速率遠(yuǎn)低于 Asn[9]。Asn 的脫酰胺包括兩步反應(yīng)，先形成五元環(huán)的琥珀酰亞胺，再發(fā)生環(huán)內(nèi)酰胺鍵水解（圖 1）。環(huán)內(nèi)酰胺鍵斷裂可發(fā)生在琥珀酰亞胺的任何一端并形成天冬氨酸（Asp）和異天冬氨酸（isoAsp），但最終蛋白中的脫酰胺產(chǎn)物多為 Asp，其可能是 Asp 作為天然氨基酸更能穩(wěn)定存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中[10]，Asn 的脫酰胺速率受蛋白質(zhì)的氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)、儲存溫度和pH值、離子種類和離子強(qiáng)度等因素影響[9-11]。在脫酰胺位點(diǎn)識別方面，離子交換色譜因分離含 Asp 與 IsoAsp 多肽存在一定難度導(dǎo)致其用于脫酰胺化研究存在局限性[12]。羧酸甲基轉(zhuǎn)移酶法分析 Asn 脫酰胺位點(diǎn)具有特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但檢測過程繁瑣且需要使用難以獲得的工具酶，導(dǎo)致該方法應(yīng)用并不十分廣泛[13]。反相色譜具有分辨率高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，盡管使用反相色譜可區(qū)分發(fā)生脫酰胺前后的多肽，但多肽的分離度對結(jié)果影響較大[14]，而高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可通過色譜分離脫酰胺前后的多肽，利用質(zhì)譜技術(shù)識別脫酰胺化位置等優(yōu)點(diǎn)，在脫酰胺化研究中的應(yīng)用日益增多[6, 8]。

Asn、Asu、Asp、isoAsp 理論分子量按單一同位素計(jì)算

Figure 1 The mechanism of asparagine deamidation and aspartic acid isomerization via succinimide intermediate

重組人血管內(nèi)皮抑制素（rhEndostatin）是一種在大腸桿菌中表達(dá)用于治療腫瘤的蛋白質(zhì)藥物，與人 XVIII 膠原蛋白的羧基末端具有同源性[15]。rhEndostatin 具有特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能，從而起到抗腫瘤作用[16]。本研究以重組人血管內(nèi)皮抑制素為模型蛋白，利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了不同放置條件下天冬酰胺殘基的變化，探索其脫酰胺化的規(guī)律，為蛋白質(zhì)藥物儲存過程中的穩(wěn)定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 重組人血管內(nèi)皮抑制素（批號 20070303）為煙臺麥得津生物工程股份有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（序列純）購自美國 Promega 公司；二硫蘇糖醇（DTT）購自美國 Sigma 試劑公司；三氟乙酸（TFA）和乙腈為美國 Merck 公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由美國安捷倫公司的 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo Fisher公司的 LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集軟件和多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件分別為 Xcalibur 1.3 和Bioworks 3.1。

1.2 方法

1.2.1 rhEndostatin 樣品處理 將重組人血管內(nèi)皮抑制素樣品溶于不同 pH 的 Tris-HCl 溶液（0.1 mol/L，pH 3.0、4.0、5.0），濃度控制在1 mg/ml；將各樣品溶液放置在 70 ℃條件恒溫處理，每 24 h 取樣 200 μl；使用 pH 10.0 的 Tris-HCl緩沖液將提取的每個樣品的 pH 調(diào)至 8.0，加入胰蛋白酶（1mg/ml，0.05 mol/L NH4HCO3，pH 8.0），加入比例為 50:1（蛋白質(zhì)：酶），37 ℃放置 6 h 后加入 5 μl DTT（0.4 mol/L，0.05 mol/L NH4HCO3），混合均勻后于 37 ℃恒溫反應(yīng) 30 min 以打開全部二硫鍵，將該多肽混合物于–20 ℃放置。

利用上述方法將重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液分別在 37 和 50 ℃條件下放置，研究溫度對脫酰胺過程的影響。不同 pH 條件下的樣品按照相同的方法將實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。實(shí)驗(yàn)利用同一樣品不同濃度條件下通過脫酰胺化和未發(fā)生脫酰胺化多肽的峰面積考察方法的穩(wěn)定性。

1.2.2 高效液相色譜質(zhì)譜設(shè)置參數(shù) 色譜柱：Agilent SB C18(150 mm × 2.1 mm，5 μm)；流動相 A：水（含 0.3% TFA），B：乙腈（含 0.3% TFA）；梯度：0 ~ 120 min，0 ~ 40% B，120 ~ 150 min，40% ~ 100% B；流速：0.2 ml/min，進(jìn)樣量 20 μl。離子源（ESI）噴霧電壓 4.5 kV；毛細(xì)管溫度300 ℃；鞘氣（N2）60 個單位（約 400 kPa）；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z330 ~ 2000；精確質(zhì)量數(shù)掃描（zoomscan）和二級質(zhì)譜（MS/MS）掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描（data dependent scan），動態(tài)排除次數(shù) 1；動態(tài)排除時(shí)間 0.5 min；二級質(zhì)譜碰撞能量為 35%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 Bioworks 3.1 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)檢索過程重點(diǎn)檢測含天冬酰胺的多肽，當(dāng)檢測出的多肽與其理論質(zhì)荷比（m/z）之差為1 時(shí)，通過二級質(zhì)譜確認(rèn)該多肽中 Asn 是否發(fā)生了脫酰胺。

2 結(jié)果

2.1 脫酰胺化位點(diǎn)識別

重組人血管內(nèi)皮抑制素共含有 184 個氨基酸，有4 個 Asn，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索分析并結(jié)合各色譜峰中的多肽識別結(jié)果表明含Asn 的多肽均能實(shí)現(xiàn)完全分離（圖 2），同時(shí)發(fā)現(xiàn)僅多肽SVWHGSDPNGR（m/z 1211.7）中的Asn 發(fā)生了脫酰胺化。

將重組人血管內(nèi)皮抑制素在一定的 pH 和溫度條件下進(jìn)行脫酰胺加速實(shí)驗(yàn)，Asn 在非酶催化條件下發(fā)生的脫酰胺化一般經(jīng)過琥珀酰亞胺中間產(chǎn)物再形成 isoAsp 和 Asp。圖 3 為重組人血管內(nèi)皮抑制素在 pH 5.0、70 ℃放置不同時(shí)間后其酶解產(chǎn)物中 m/z 1211.7 和 1212.7 的提取離子流圖，色譜峰P2 和 P3 對應(yīng)的多肽VWHGSDPN*GR 中第 8 位氨基酸應(yīng)分別為 isoAsp 和 Asp，兩者比例約為 2:1[3]。

相對豐度Relative abundance 時(shí)間（min） Time (min)

Figure 2 Total ion current chromatogram of the tryptic digest of rhEndostatin

相對豐度Relative abundance 時(shí)間（min） Time (min)

Figure 3 Extracted ion chromatograms for m/z 1211.7 and 1212.7 of the tryptic digest of rhEndostatin

Asn 發(fā)生脫酰胺化后形成Asp（或isoAsp），質(zhì)量數(shù)增加 1 Da。以圖 3C 為例，保留時(shí)間為 50.34 min 的色譜峰中檢測出帶單電荷的離子 m/z 1211.7 和帶雙電荷的離子 m/z 606.4（圖 4A），其二級質(zhì)譜表明離子 m/z 1211.7 和 m/z 606.4 來自多肽SVWHGSDPNGR（圖 4C）；保留時(shí)間為 50.95 和 52.70 min 的色譜峰中均檢測出帶單電荷的離子 m/z 1212.7 和帶雙電荷的離子 m/z 606.9（圖 4B），二級質(zhì)譜表明離子 m/z 1212.7 和 m/z 606.9 來自多肽 VWHGSDPDGR（圖 4D），表明多肽 VWHGSDPNGR 中的天冬酰胺發(fā)生了脫酰胺化。多肽序列中 Asn 殘基的脫酰胺化將導(dǎo)致多肽親/疏水性發(fā)生變化，本研究為有效分離發(fā)生脫酰胺化和未發(fā)生脫酰胺化的多肽，實(shí)驗(yàn)中降低了色譜流動相的梯度。

2.2 pH 對脫酰胺過程的影響

通過測定重組人血管內(nèi)皮抑制素在70 ℃、不同 pH 條件下放置后其酶解產(chǎn)物中多肽 VWHGSDPGR 和 VWHGSDPGR 的相對含量，以便計(jì)算出在相同溫度，不同 pH 條件下 VWHGSDPGR 發(fā)生脫酰胺的比例。在放置初期重組人血管內(nèi)皮抑制素中 Asn127的脫酰胺化的比例隨時(shí)間延長逐漸增加（圖 5），4 d 后脫酰胺化多肽的相對含量變化趨于穩(wěn)定。在方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，利用同一樣品研究了不同濃度溶液通過積分脫酰胺化和未發(fā)生脫酰胺化多肽的峰面積以考察方法的穩(wěn)定性，結(jié)果表明方法的日內(nèi)穩(wěn)定性和日間穩(wěn)定性的 RSD 均低于 2.8%。

圖 4 提取離子流圖 3C 中保留時(shí)間為 50.34、50.95 min 多肽的譜圖（A、B：質(zhì)譜圖；C、D：二級質(zhì)譜圖）

Figure 4 Spectra of peptide contained in the chromatgraphic peaks with retention time 50.34 and 50.95 min in Figure 3C (A, B: Mass spectra; C, D: MS/MS spectra)

圖 5 不同 pH 條件下發(fā)生脫酰胺重組人血管內(nèi)皮抑制素的百分含量

Figure 5 The deamidation percentage of rhEndostatin incubated at different pH

研究表明在一定溫度條件下非酶催化的脫酰胺過程為一級反應(yīng)[17]，在不考慮逆反應(yīng)的條件下，脫酰胺過程的反應(yīng)速率與未發(fā)生脫酰胺蛋白的濃度呈比例，脫酰胺化蛋白濃度可用如下方程表示：

P=P（－-kt），P=Pe-kt。其中，P表示未發(fā)生脫酰胺化的蛋白濃度；P表示發(fā)生脫酰胺的蛋白濃度；P表示總蛋白濃度；表示脫酰胺反應(yīng)的速率常數(shù)。

本研究測定了不同pH 條件下重組人血管內(nèi)皮抑制素脫酰胺的速率，如圖6 所示。計(jì)算表明在70 ℃、pH 分別為 3.0、4.0、5.0 條件下重組人血管內(nèi)皮抑制素的脫酰胺速率常數(shù)分別為1= 0.29 d-1、2= 0.38 d-1、3= 0.45 d-1。

2.3 溫度對脫酰胺過程的影響

本研究確定了重組人血管內(nèi)皮抑制素在相同pH、不同溫度條件下放置過程中脫酰胺隨時(shí)間的變化趨勢。圖 7 是在 pH 5.0，溫度分別為 37、50 和 70 ℃條件下不同放置時(shí)間重組人血管內(nèi)皮抑制素中 Asn127發(fā)生脫酰胺化的變化趨勢。由圖 7 可見脫酰胺速率隨溫度升高而逐漸加快。

圖 6 不同 pH 條件下重組人血管內(nèi)皮抑制素脫酰胺反應(yīng)速率常數(shù)

Fgiure 6 The kinetic constant of deamidation process of the rhEndostatin incubated at different pH

圖 7 pH 5.0，不同溫度重組人血管內(nèi)皮抑制素脫酰胺含量變化

Figure 7 The deamidation percentage of rhEndostatin incubated at pH 5.0 and different temperature

本研究測定了上述條件下Asn127脫酰胺化的速率常數(shù)（圖 8）。結(jié)果表明在 37、50、70 ℃三個溫度下的脫酰胺速率常數(shù)分別為1= 0.0093 d-1、2= 0.068 d-1、3= 0.38 d-1。

圖 8 pH 5.0，不同溫度重組人血管內(nèi)皮抑制素脫酰胺反應(yīng)的速率常數(shù)

Figure 8 The kinetic constant of deamidation process of the rhEndostatin incubated at pH 5.0 and different temperature

3 討論

在脫酰胺位點(diǎn)識別方面，本研究僅檢測到多肽SVWHGSDPNGR（m/z 1211.7）中的 Asn 發(fā)生了脫酰胺，其他位置的 Asn 未檢測到明顯的脫酰胺化，說明 Asn 羧基端的氨基酸對其脫酰胺速率影響較大，當(dāng)與 Asn 羧基相連的氨基酸為 Gly 時(shí)，Asn 非常容易發(fā)生脫酰胺化，可能原因是與 Asn 羧基相連的氨基酸側(cè)鏈越長，則空間位阻越大，Asn 側(cè)鏈的 N 難以被接近導(dǎo)致脫酰胺不易發(fā)生，溶劑能進(jìn)入 Asn 的側(cè)鏈區(qū)域和Asn 所在的局部結(jié)構(gòu)具有靈活可變性是 Asn 發(fā)生脫酰胺化的重要條件。因此，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)對 Asn 的脫酰胺速率有一定影響[11]。同時(shí)，當(dāng) Asn 后面的氨基酸為極性且側(cè)鏈較短時(shí)，如 Ser、The 和 Asp，脫酰胺難度相對有所增加；當(dāng) Asn 后面的氨基酸為疏水性且側(cè)鏈較長時(shí)，Asn 發(fā)生脫酰胺化的難度更大。

在 pH 值對脫酰胺速率影響方面，Vlasak 等[18]研究了人 IgG1 抗體輕鏈 CDR1 中 Asn 脫酰胺隨 pH 的變化，表明在 pH 4.0 ~ 7.0 范圍內(nèi)，Asn 脫酰胺速率也呈隨 pH 升高而增加的趨勢。由本實(shí)驗(yàn)測定脫酰胺速率常數(shù)發(fā)現(xiàn)，在相同溫度條件下，pH 3.0 ~ 5.0 范圍內(nèi)脫酰胺速率隨著 pH 值的上升而增加，其可能原因是脫酰胺化過程是一親核反應(yīng)，堿性條件下親核反應(yīng)更容易進(jìn)行，故隨著 pH 升高酸性逐漸減弱，堿性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致反應(yīng)速率常數(shù)在一定范圍內(nèi)逐漸增加。

在溫度對脫酰胺速率的影響方面，通過研究發(fā)現(xiàn)，在相同的 pH 條件下，隨著溫度的升高天冬酰胺脫酰胺反應(yīng)速率逐漸增大。在不考慮溫度對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響條件下，反應(yīng)速率常數(shù)與溫度之間的關(guān)系應(yīng)符合阿累尼烏斯方程，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出的速率常數(shù)與溫度之間的關(guān)系并不完全符合阿累尼烏斯方程，其可能原因是溫度升高對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，使得重組人血管內(nèi)皮抑制素疏水性的結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集，而親水性的結(jié)構(gòu)域暴露在蛋白質(zhì)外部，導(dǎo)致脫酰胺化過程加快。因此，溫度變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對脫酰胺過程存在一定影響。

重組人血管內(nèi)皮抑制素中天冬酰胺的脫酰胺過程受其氨基酸序列、儲存溫度和 pH 值影響，且在一定條件下隨著溫度和 pH 值的升高，脫酰胺速率逐漸加快。脫酰胺化是藥物蛋白存放過程中化學(xué)降解和活性降低的重要原因之一[19]，研究藥用蛋白質(zhì)在不同條件下的脫酰胺過程對于篩選合適的儲存條件、減少活性損失具有參考價(jià)值。

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Effect of temperature and pH on the deamidation process of Asn in rhEndostain

XIE Ru, ZHANG Gui-feng, GAO Jian-ping, WANG Ming-lin,MA Run-yu, SU Zhi-guo

Author Affiliations: College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China (XIE Ru, MA Run-yu); State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China (ZHANG Gui-feng, SU Zhi-guo); College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China (GAO Jian-ping, WANG Ming-lin)

To investigate the effect of temperature and pH on the deamidation process of asparaginyl (Asn) in the rhEndostatin using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

The samples of rhEndostatin were incubated at different temperature and pH, and then digested by trypsin. The peptides in the digest mixture were analyzed to identify the deamidation site of Asn. The ratio of deamidation of sample inculated at different temperature and pH was determined.

The Asn in the peptide, SVWHGSDPNGR, was found to deamidate and transform into asparate (Asp) and isoaspartate (isoAsp). No obvious deamidation in Asn except in the SVWHGSDPNGR was observed. The effect of incubation temperature and pH on the deamidation process and kinetic constant was investigated. The kinetic constant of Asn deamidation is accelerating with the increasing of temperature and the pH of solution.

The deamidation process of Asn in rhEndostatin is affected by the pH of solution and the temperature of storage. Thus, studying of the deamidation of pharmaceutical proteins in different conditions is important for selecting proper storage environment and reducing the loss of activity.

Angiostatins; Asparagine; Peptides; Chromatography, high pressure liquid

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.002

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2007AA021604）

張貴鋒，Email：gfzhang@home.ipe.ac.cn

2009-11-16

ZHANG Gui-feng, Email: gfzhang@home.ipe.ac.cn

中國醫(yī)藥生物技術(shù)