李義良，易進(jìn)華，夏佳慧，周文艷，范麗麗

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PCR引物濃度對寡核苷酸液相雜交的影響

李義良，易進(jìn)華，夏佳慧，周文艷，范麗麗

201210 上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司

考察 PCR 引物濃度配比對液相微珠雜交效率的影響，尋求具有較強(qiáng)雜交信號(hào)和較好穩(wěn)定性的 PCR 引物濃度配比。

建立 HLA-DRB1 等位基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫，選擇在 HLA-DRB1 位點(diǎn)的第二外顯子上設(shè)計(jì)探針，并且選擇其保守序列作為陽性對照探針（DPC2），DPC2 探針中間位點(diǎn) T 突變成 A 作為陰性對照探針（DNC）。分別針對標(biāo)本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設(shè)計(jì)出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針，各探針 5’ 端用氨基（NH2）修飾。通過引物濃度梯度配比（1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1），對型別已知的細(xì)胞株 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并得到目的片段（1:100 配比除外），在相同條件下將 PCR 產(chǎn)物與寡核苷酸探針進(jìn)行液相雜交檢測。

濃度配比為 1:1 的對稱式擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果不理想，而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對稱擴(kuò)增均得到了待檢單鏈、雙鏈 DNA 混合物，其中 1:4 濃度配比具有最好的擴(kuò)增效率和穩(wěn)定性。根據(jù)陽性信號(hào)與陽性標(biāo)本是否相符表明：引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 檢測效果差，易出現(xiàn)假陰性；1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測效果較好，比較穩(wěn)定。

PCR 引物濃度配比影響液相微珠雜交效率，不對稱 PCR 產(chǎn)物有利于提高雜交效率，為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎(chǔ)，有利于寡核苷酸液相芯片的應(yīng)用。

聚合酶鏈反應(yīng)； 寡核苷酸序列分析； 核酸雜交

液相芯片是 20 世紀(jì) 90 年代中期發(fā)展起來的，以美國 Luminex 公司的 xMAP（flexible multi- analyte profiling）技術(shù)為基礎(chǔ)，既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對高通量的新一代分子檢測技術(shù)平臺(tái)[1-2]。xMAP 液相芯片體系由許多不同顏色的微珠為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種微珠表面共價(jià)連接有不同的寡核苷酸探針分子，將這些微珠懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)。雜交在懸浮的液相中進(jìn)行，空間位阻小，所需反應(yīng)時(shí)間短，雜交后不用清洗就可以直接讀數(shù)，檢測效率大大高于固相雜交。xMAP 液相基因芯片已廣泛應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析[3]、組織相容性抗原分型[4]、基因表達(dá)分析等[5]研究，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測。目前寡核苷酸間的分離和雜交過程已被進(jìn)行了較深入的研究[6-7]，但仍有很多問題亟待解決。影響寡核苷酸液相芯片雜交效果的因素有很多，樣品制備是其中一重要影響因素。傳統(tǒng)對稱 PCR，擴(kuò)增所得產(chǎn)物為雙鏈 DNA，不經(jīng)過堿變性或熱變性，無法同寡核苷酸探針雜交。即使通過變性步驟后，雜交效率也比較低。而且，DNA 雙鏈間的復(fù)性作用力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于核酸與寡核苷酸探針間的雜交作用力，造成雜交信號(hào)較弱或不穩(wěn)定。用單鏈進(jìn)行雜交被認(rèn)為是排除雙鏈干擾、得到理想雜交結(jié)果的較好方式[8-10]。

不對稱 PCR 由 Gyllensten 和 Erlich[11]在 1988 年首次提出，常被用于獲得單鏈 DNA，目前文獻(xiàn)一般認(rèn)為其限制性引物和非限制性引物濃度最佳配比為 1:50 ~ 1:100，擴(kuò)增效率較低、不穩(wěn)定、難以優(yōu)化并且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。研究表明，相對于傳統(tǒng)對稱 PCR，不對稱 PCR 擴(kuò)增效率只有 60% ~ 70%，而前者可達(dá)到 90%，甚至更高[12-13]。此外，還需要控制引物和模板數(shù)量，因而，往往不能保證每次不對稱 PCR 擴(kuò)增都獲得成功。如兩條引物濃度相差太大，限制性引物濃度太低，其對稱擴(kuò)增效率也會(huì)大大降低。

本文比較了 PCR 引物濃度配比對寡核苷酸液相雜交的影響，尋求具有一定擴(kuò)增效率，能獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)和穩(wěn)定性的引物濃度配比，以便于建立成功率較高的 PCR 試劑配制標(biāo)準(zhǔn)操作程序，促進(jìn)寡核苷酸液相芯片的 SNP 檢測和臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn) DNA HLA 基因型別已知 DNA 標(biāo)本：C2-008、C2-024、C2-025 購于美國 UCLA（University of California，Los Angeles）免疫遺傳學(xué)中心，濃度 50 ng/μl，純度 OD260/280 1.65 ~ 2.0。標(biāo)本相應(yīng)基因型詳見表 1 中陽性標(biāo)本列。

表 1 寡核苷酸探針序列及對應(yīng)陽性標(biāo)本

1.1.2 試劑與微珠 Taq DNA 聚合酶為上海博彩公司產(chǎn)品；鏈親素修飾的藻紅蛋白 PJ31S （StreptavidinR-phycoerythrin，SAPE），2.02 mg/ml，購于美國 Prozyme 公司；雜交液為上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；羧基修飾的聚苯乙烯熒光微珠 L100-C103、L100-C105、L100-C107、L100-C113、L100-C130、L100-C197 為美國 Luminex 公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能懸浮點(diǎn)陣儀 Luminex- 100TM購自美國 Luminex Corp 公司；9700 PCR 儀購自美國 ABI 公司；EPS 3500 電泳儀和凝膠成像儀均購自美國 Pharmacia 公司；5810R 型平板離心機(jī)購自德國 Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 雜交微珠制備方法

1.2.1.1 引物與探針的設(shè)計(jì)、合成與標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[4]，并檢索 Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih. gov）以及 EMBL（http://www.ebi.ac.uk）數(shù)據(jù)庫中的 HLA-DRB1 基因序列進(jìn)行整理，建立了 HLA- DRB1 等位基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫。HLA-DRB1 基因的第二外顯子的 PCR 引物序列為：上游引物 P1（5’ CCGGATCCTTCGTGTCCCCACACG 3’），下游引物 P2（5’ CCGCTGCACTGTGAAGCTCTC 3’）。下游引物 P2 的 5’ 端進(jìn)行生物素標(biāo)記。

根據(jù) HLA 等位基因的變異特點(diǎn)，選擇在 HLA-DRB1 位點(diǎn)的第二外顯子上設(shè)計(jì)探針，并且選擇第二外顯子上的保守序列作為陽性對照探針（DPC2），DPC2 探針中間位點(diǎn) T 突變成 A 作為陰性對照探針（DNC）。分別針對標(biāo)本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設(shè)計(jì)出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針，各探針 5’ 端用氨基（NH2）修飾。上述引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。表 1 為寡核苷酸探針具體序列及對應(yīng)成陽性反應(yīng)的標(biāo)本。

1.2.1.2 探針耦聯(lián) ①耦聯(lián)條件：0.1 mol/L的（N-嗎啡基）乙磺酸（MES）（pH 4.5），50 μl；0.1 nmol 氨基修飾寡核苷酸探針；2.5 × 106個(gè)羧基修飾熒光微珠（不同顏色編號(hào)），加入 2.5 μl 40 mg/ml 的 1-乙基-（3-二甲基-丙烷）氫氯化二亞胺（EDC）作為催化劑，混合后室溫條件下孵育 30 min（第 15 分鐘時(shí)渦漩混勻一次），然后加入新鮮配制的 EDC 溶液 2.5 μl，室溫條件下孵育 30 min；加入 1 ml 0.02% 吐溫–20，上下顛倒搖勻洗滌，13 000 r/min 離心 2 min，吸除上清；加入 1 ml 0.1% SDS（十二烷基硫酸鈉），重懸 Beads，上下顛倒混勻洗滌；12 000 r/min 離心 2 min，吸除上清；50 μl Tris-EDTA緩沖液（pH 8.0，NaN3）重懸 Beads，渦漩混勻，4避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②質(zhì)檢：選取型別已知，針對各探針反應(yīng)結(jié)果均有陰性和陽性的不同標(biāo)本作為質(zhì)控標(biāo)本，雜交檢測，探針表現(xiàn)和理論一致，陽性、陰性對應(yīng)出現(xiàn)，則表明耦聯(lián)成功，質(zhì)檢合格。

1.2.1.3 微珠的制備 探針耦聯(lián)質(zhì)檢后混合，使每種編號(hào)微珠數(shù)量為 5 000 個(gè)/μl，組成液相雜交微珠。

1.2.2 樣品的制備

1.2.2.1 對稱 PCR 擴(kuò)增 ①反應(yīng)體系：模板DNA 2 μl（50 ng/μl），P1、P2 引物量均為 0.4 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.2 μl（5 U/μl），10′Buffer 2 μl，加雙蒸水 dd H2O 至終體積 20 μl。②PCR 反應(yīng)條件：96 ℃，3 min；96 ℃，20 s，60 ℃，20 s，72 ℃，20 s，5 個(gè)循環(huán)；然后 95 ℃，10 s，60℃，15 s，72 ℃，20 s，35 個(gè)循環(huán)；再 72 ℃延伸 10 min。每一樣品分別做 3 個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.2.2 不對稱 PCR 擴(kuò)增 固定下游引物 P2 量為0.4 μmol/L，提高引物 P1:P2 比例至 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50 和 1:100。PCR 反應(yīng)循環(huán)條件同對稱 PCR 條件，每一樣品分別做 3 個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)。取其中一批兩種方式 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μl，用含有溴乙錠的 3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后觀察結(jié)果。

1.2.3 芯片雜交及清洗 雜交體積為 20 μl：每孔加 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，15 μl 雜交混合液[耦聯(lián)好探針的微珠混合液 2 μl，13 μl 1.5′雜交液（4.5 mol/L氯化四甲基銨（TMAC），75 mmol/L Tris，4 mmol/L EDTA，0.15% Sarkosyl 月桂酰-N-甲基氨基乙酸鈉，pH 8.0）]。將雜交板用膜密封好后，低速充分震蕩混勻，PCR 儀 97 ℃變性 7 min，60 ℃孵育 15 min；從 PCR 儀上取下雜交板，每孔立即加 100 μl 的洗滌液（WB），覆膜，離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min，取出雜交板，迅速甩掉上清液，然后倒置在吸水紙上，去除雜交板面上殘余的液體。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮，每孔加入 120 μl WB，覆膜，離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min（期間準(zhǔn)備 1′PJ31S 熒光蛋白溶液，把 PJ31S 濃縮液 250 倍稀釋于 1′雜交液中）；取出雜交板后，迅速甩掉上清液。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮，每孔加 20 μl 的 1′PJ31S，覆膜，密封后，低速震蕩充分混勻。PCR 儀60 ℃孵育 6 min；從 PCR 儀上取下雜交板，每孔立即加 100 μl 的 WB。離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min。甩掉洗滌液，每孔加 75 μl 的 WB，吹打混勻后轉(zhuǎn)移到讀板上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Luminex 100 儀器讀取標(biāo)本，收集數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)化值（T 值），雜交檢測標(biāo)準(zhǔn)化值 T：T =（MFIProbe－MFIDNA）/（MFIDPC2－MFIDNA）× 100。陽性信號(hào)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：熒光強(qiáng)度 > 1000，熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化值明顯大于陰性標(biāo)本對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化值，其比值> 3，否則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 引物濃度梯度配比 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

引物濃度梯度配比 PCR 產(chǎn)物電泳，結(jié)果如圖 1 所示。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段的大小為 288 bp，引物濃度配比 1:100（0.004 μmol/L:0.4 μmol/L）、1:50（0.008 μmol/L:0.4 μmol/L）均有較亮的非特異性擴(kuò)增條帶，前者未觀察到目的片段，后者目的條帶也很弱。對稱 PCR（1:1 配比，0.4 μmol/L:0.4 μmol/L）產(chǎn)物雙鏈 DNA 片段最亮，但未觀察到單鏈 DNA，其他配比均有效擴(kuò)增出目的片段，為雙鏈 DNA 和單鏈 DNA 混合物，且隨著濃度不對稱配比的縮小，電泳條帶亮度逐漸增加，但0.1 μmol/L:0.4 μmol/L 配比的 PCR 產(chǎn)物單鏈 DNA 條帶最亮，同時(shí)也獲得了較亮的雙鏈 DNA，具有最好的擴(kuò)增效率和穩(wěn)定性。

2.2 引物濃度配比對液相微珠雜交結(jié)果的影響

為避免實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨機(jī)性，PCR 擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)樣品做 3 次平行考察。在相同條件下將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與寡核苷酸液相微珠進(jìn)行雜交檢測，得到相關(guān)平均值（具體每個(gè)平行孔檢測數(shù)據(jù)未顯示），如圖 2A、2B 所示。圖 2 中a、b、c 對應(yīng)標(biāo)本依次為 C2-008、C2-024、C2-025，其中圖 2A 為不同引物濃度配比 PCR 產(chǎn)物雜交后熒光強(qiáng)度均值比較，引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 時(shí)，各標(biāo)本對應(yīng)陽性探針熒光值均明顯低于其他配比雜交結(jié)果，小于 1 000（C2-024 標(biāo)本中 PD05 探針除外）。其中 1:20 配比檢測結(jié)果熒光值最高，1:8、1:4、1:2 配比檢測結(jié)果熒光值接近。圖 2B 為雜交后熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化值比較，引物濃度配比為 1:1 時(shí)，標(biāo)本對應(yīng)陽性探針其標(biāo)準(zhǔn)化值均明顯低于其他配比的雜交結(jié)果，其中在 C2-024 和C2-025 標(biāo)本中，探針 PD13 標(biāo)準(zhǔn)化值與其陰性標(biāo)本 C2-008 中的標(biāo)準(zhǔn)化值很接近，未見有陽性熒光信號(hào)（假陰性），探針 PD05 與 PD07 陽性也明顯降低。引物濃度配比為 1:100 時(shí)，陽性探針標(biāo)準(zhǔn)化值最大，但由于內(nèi)對照陽性探針 DPC2 熒光值很低，故整體結(jié)果不理想。其他配比探針陽性標(biāo)準(zhǔn)化值接近，比較穩(wěn)定。

圖 1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳比較

Figure 1 Comparison of amplification products by agarose gel electrophoresis

在同一條件下雜交檢測不同引物濃度配比所得擴(kuò)增產(chǎn)物，各柱狀圖顏色表示不同引物濃度配比。標(biāo)本分別為 a：C2-008；b：C2-024；c：C2-025。探針為陽性反應(yīng)時(shí)用“+”號(hào)表示。

Figure 2 Oligo liquid-bead hybridization results obtained from different primer concentration ratios. [A: Indicate comparison of signal intensity (average products from three individual amplifications); B: Indicate comparison of standardized value of signal intensity]

根據(jù)陽性信號(hào)是否與陽性標(biāo)本相符表明：引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 檢測效果差，易出現(xiàn)假陰性；1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測效果較好，比較穩(wěn)定。

3 討論

DNA 液相雜交較復(fù)雜，尤其當(dāng) PCR 擴(kuò)增效率低或所得產(chǎn)物為雙鏈 DNA 時(shí)，導(dǎo)致許多拷貝數(shù)低的基因無法有效檢測，許多探針出現(xiàn)假陰性，檢測靈敏性和穩(wěn)定性差。我們在試劑研發(fā)、配制生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)：同一序列引物，合成后按對稱 PCR 擴(kuò)增質(zhì)檢，檢測效果好，陽性信號(hào)強(qiáng)，但再次合成后按同一引物濃度配比進(jìn)行對稱 PCR 擴(kuò)增檢測，電泳觀察，目的片段大小正確，條帶很亮，但雜交檢測陽性信號(hào)很弱，按對稱 PCR 方式調(diào)整引物濃度，檢測結(jié)果也無改觀。按不對稱 PCR 方式調(diào)整引物濃度配比后，電泳條帶相對較弱，甚至很弱時(shí)也獲得了較好的檢測結(jié)果。因此，建立具有一定擴(kuò)增效率，同時(shí)又能產(chǎn)生大量單鏈的 PCR 方法、提高液相芯片的重復(fù)性、可靠性和敏感性非常重要。

DNA 雙鏈中只有一條鏈可與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，另一條鏈則作為干擾鏈存在。本研究結(jié)果與此一致：引物濃度配比為 1:1 的對稱 PCR 產(chǎn)物，電泳條帶雖很亮，但雜交后陽性探針（DPC2）熒光值很弱，較其他不對稱 PCR（濃度配比為 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50）的熒光值偏低很多。在 C2-024、C2-025 標(biāo)本中，探針 PD13 未見有陽性熒光信號(hào)，出現(xiàn)假陰性；對應(yīng) C2-025 標(biāo)本，PD07 探針熒光值信號(hào)與陰性標(biāo)本（C2-024）熒光值信號(hào)接近，也未見有明顯陽性熒光信號(hào)（假陰性）；C2-024 標(biāo)本中，PD05 探針熒光值信號(hào)也明顯低于其他配比檢測到的熒光值信號(hào)。Wei 等[8]也觀察到：當(dāng)引物濃度高于 0.63 μmol/L 時(shí)，隨著雙鏈 DNA 量的增加，雜交檢測的信號(hào)強(qiáng)度反而降低。對此現(xiàn)象很難找出具體原因，高濃度的雙鏈靶分子可能存在較高的自我退火比率，增加了雜交的競爭壓力，從而降低雜交效率。另外，微珠表面一定范圍內(nèi)靶分子太多，可能造成空間擁擠，反而降低雜交效率，不易與探針雜交。我們在室溫下加入適量強(qiáng)堿反應(yīng)15 min，使雙鏈變性，用適量醋酸中和再進(jìn)行后續(xù)雜交檢測，但結(jié)果與熱變性結(jié)果一致：雜交對稱 PCR 產(chǎn)物，探針仍有假陰性出現(xiàn)（數(shù)據(jù)未顯示），可能在雜交過程中互補(bǔ)鏈仍會(huì)與探針競爭與靶鏈 DNA 的雜交，使反應(yīng)體系中實(shí)際用于雜交的靶序列濃度降低，從而影響雜交效率。

不對稱 PCR 產(chǎn)物雜交檢測結(jié)果，均沒有假陰性情況出現(xiàn)，而且陽性信號(hào)較強(qiáng)、較穩(wěn)定，用單鏈進(jìn)行雜交可排除雙鏈干擾、得到理想雜交結(jié)果[8-10]。引物濃度配比為 1:100 時(shí)，標(biāo)本對應(yīng)陽性探針均很強(qiáng)，但由于內(nèi)對照陽性探針 DPC2 熒光值很低，故整體結(jié)果不理想，不能采用。

綜上所述：對稱式擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果不理想，而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對稱式擴(kuò)增顯著地提高雜交效率，有利于寡核苷酸液相雜交微珠的應(yīng)用。采用 1:4（0.1 μmol/L:0.4 μmol/L）引物配比進(jìn)行不對稱 PCR 擴(kuò)增，可保證一定的擴(kuò)增效率和單鏈 DNA 的生成，配制 PCR 引物反應(yīng)液時(shí)，可以此引物濃度配比為基準(zhǔn)進(jìn)行測試調(diào)整，為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎(chǔ)。

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Effects of the primer concentration on the liquid-phase oligonucleotide hybridization

LI Yi-liang, YI Jin-hua, XIA Jia-hui, ZHOU Wen-yan, FAN Li-li

Author Affiliation: Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., 201210, China

This study investigated the impact of ratios of PCR primer concentration on the liquid-Bead hybridization efficiency to find appropriate ratio of primer concentration with a stronger hybridization signal and the hybrid stability.

Database of HLA-DRB1 alleles was established. Probes were designed according to the sequence of exon 2 of HLA-DRB1 locus. Conserved sequence were selected for positive control probe design (DPC2). Negative control probe was synthesized through a mutation from T to A in the middle of the sequence of DPC2. Six oligo probes about 21 bp were designed specially targeted to allele sequences from samples C2-008, C2-024 and C2-025 separately. The 5'-terminal sequences of each probe were modified by NH2. Genomic DNA from cell lines with known types was amplified with different ratios of primer concentration (1:100, 1:50, 1:20, 1:8, 1:4, 1:2, 1:1). Target fragments were obtained except from amplification with 1:100 ratio. PCR products were hybridized with oligonucleotide probes by liquid hybridization under same conditions.

Hybridization results from symmetric PCR products by concentration ratio of 1:1 are not satisfactory, while mixture of single-strand DNA and double-stranded DNA under test was obtained from asymmetric amplifications by ratios of 1:20, 1:8, 1:4, and 1:2, in which the best amplification efficiency and stability from the concentration ratio of 1:4. From the consistency of positive samples and positive signals, false negative results were common due to ratios of primer concentration 1:100 and 1:1.

The concentration ratio of PCR primers affects the efficiency of liquid-phase bead hybridization. Asymmetric PCR products help improve the hybridization efficiency. Our results established the foundation to prepare PCR reagents quickly and successfully in favour of liquid-phase oligonucleotide chip applications. Better results and stability would be expected using other ratios.

Polymerase chain reaction; Oligonucleotide array sequence analysis; Nucleic acid hybridization

LI Yi-liang, Email: yiliangli@yahoo.com.cn

李義良，Email：yiliangli@yahoo.com.cn

2009-11-23

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.008