司磊，趙岐剛，劉朝陽，張偉

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慢病毒靶向攜帶survivin-siRNA抗肺腺癌裸鼠體內(nèi)研究

司磊，趙岐剛，劉朝陽，張偉

252000 山東，聊城市人民醫(yī)院檢驗科（司磊、趙岐剛）；100021 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院檢測中心（劉朝陽、張偉）

探討慢病毒載體介導(dǎo) survivin-siRNA 對人肺腺癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)抑瘤活性。

參考 siRNA 的設(shè)計策略，構(gòu)建表達(dá)survivin-siRNA 的慢病毒載體；于各 BALB/C 裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種人肺腺癌 A549 細(xì)胞懸液，構(gòu)建人肺腺癌A549 細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，腫瘤組織局部注射 survivin-siRNA 的慢病毒載體，觀察腫瘤的體積及隨時間變化的生長曲線；通過碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞周期變化。

慢病毒載體介導(dǎo) survivin-siRNA 對裸鼠人肺腺癌 A549 的抑瘤率為 46.07%；經(jīng)過 PI 和 Annexin-V 染色區(qū)分凋亡早晚期的細(xì)胞為30% ~ 35%，熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞凋亡；G1 期細(xì)胞比例明顯增加，S 期細(xì)胞比例則明顯減少。

慢病毒載體介導(dǎo)的 siRNA 能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌 A549 的 survivin 基因的表達(dá)，有效激發(fā)細(xì)胞凋亡。

RNA，小分子干擾； 遺傳載體； 慢病毒屬； 腫瘤，實驗性； 生存素

RNAi 技術(shù)又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默，近年來國內(nèi)外諸多研究人員就 RNAi 技術(shù)用于臨床治療方面給予了肯定[1-2]，如果利用 RNAi 的基因沉默作用抑制體內(nèi)原癌基因的激活，腫瘤的發(fā)生率就會降低，甚至可以永久地避免相關(guān)腫瘤的發(fā)生[3]。

生存素（survivin）在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)豐富且與預(yù)后不良相關(guān)，正常成人組織不表達(dá)，這種選擇性表達(dá)的特性受到矚目[4]，并已成為目前惡性腫瘤基因診斷和治療的新靶點。survivin 是 caspase-3 和 caspase-7 的直接抑制劑，從而阻斷凋亡過程。同時，survivin 通過細(xì)胞周期依賴性表達(dá)，可對抗 G2/M 期凋亡的誘導(dǎo)，其在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)可克服凋亡的關(guān)卡，通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的異常增殖[5]。由于幾乎所有人類腫瘤中都有survivin 表達(dá)，可拮抗由Fas、Bax、caspase-3、caspase-7 和抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]，從而促進(jìn)細(xì)胞增生或影響抗癌藥物的治療效果。抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的 2 個重要指標(biāo)。設(shè)計和構(gòu)建沉默靶基因的 siRNA 慢病毒表達(dá)載體，siRNA 重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T，產(chǎn)生的含有 siRNA 表達(dá)序列的慢病毒感染靶細(xì)胞發(fā)揮基因沉默的作用穩(wěn)定而持久。本研究通過構(gòu)建慢病毒載體并介導(dǎo) RNAi 來沉默 survivin 基因在移植瘤裸鼠肺腺癌的體內(nèi)表達(dá)，以探索其作為腫瘤靶向性治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BALB/C 品系裸鼠，雄性，平均體重 17 ~ 18 g，SPF 級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育提供，許可證號 SCXK（京）20050013。survivin-siRNA、慢病毒載體、DMEM 培養(yǎng)基及 293T 細(xì)胞株購自上海吉凱基因公司；碘化丙啶（PI）、PBS、Annexin-V、大腸桿菌 DH5α 由聊城市人民醫(yī)院中心實驗室提供；人肺腺癌 A549 細(xì)胞株由 Giard DJ 等建株[7]，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.2 方法

1.2.1 survivin-siRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 參考 siRNA 的設(shè)計策略，選擇 survivin 基因 cDNA 序列上 1 個位點，利用 BLAST 確定序列特異性，設(shè)計并合成其 shRNA 的 DNA Oligo，退火形成雙鏈 DNA，酶切、連接載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 后進(jìn)入 pGCL-GFP 表達(dá)質(zhì)粒?；旌?pGCL-GFP 載體 20 μg，pHelper1.0（gag/pol 元件）載體 15 μg，pHelper2.0（VSVG 元件）載體 10 μg，包裝入 293T 細(xì)胞。實驗分為空白載體組、空白對照組和 RNAi組為 survivin特異性 siRNA 表達(dá)載體。

1.2.2 人肺腺癌實體移植瘤裸鼠模型建立及裸鼠體內(nèi)實驗 于各 BALB/C 裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種人肺腺癌 A549 細(xì)胞懸液 8 × 106C/鼠，待腫瘤生長至長徑 × 短徑約 10 mm × 5 mm 時，將動物隨機(jī)分為空白對照組、空白病毒載體組、surviving- RNAi 病毒載體組（RNAi 組），每組動物 6 ~ 8 只，裸鼠飼養(yǎng)在 SPF 級屏障系統(tǒng)內(nèi)設(shè) IVC 環(huán)境內(nèi)，3 ~ 4 只動物于同一塑料盒中，給予 SPF 級動物專用料塊，自由飲用蒸餾水。飼養(yǎng)室溫度 20 ~5 ℃、日溫差≤ 3 ℃，相對濕度 40% ~ 60%、光照12 h 明暗交替，空氣潔凈度為 100 級，氨濃度≤ 14 mg/m3，噪聲≤ 60 分貝，工作照度為 150 ~ 300克斯（LX），動物照度為 100-200 LX。動物稱體重標(biāo)號后 3 組動物分別每鼠瘤內(nèi)注射生理鹽水、空白病毒載體、survivin-siRNA 慢病毒表達(dá)載體 50 μl 一次。于接種腫瘤后第 4 周末處死動物，完整剝?nèi)×鰤K并稱重，計算抑瘤率，實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

腫瘤體積測定（）= 1/2[腫瘤長徑（）× 腫瘤短徑（）2][ 8-9]

1.2.3 凋亡細(xì)胞細(xì)胞核著色 通過PI 染色，在熒光顯微鏡 488 nm 激發(fā)光條件下檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞核著色情況、拍照計數(shù)，并統(tǒng)計分析。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期分布的觀察 采用常規(guī)胰酶消化、收集腫瘤組織細(xì)胞 1 × 106~ 5 × 106/ml 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測、PI 染色，觀察細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤生長曲線

survivin-siRNA 慢病毒載體瘤內(nèi)注射，腫瘤移植接種時間共計 28 d，實驗期間 3 組動物無死亡，實驗前后動物體重?zé)o顯著變化，RNAi 組抑瘤率為 46.07%。與空白對照組、空白病毒載體組比較差異極顯著（< 0.01），空白病毒載體組與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）（表 1、2）。

2.2 細(xì)胞凋亡的檢測

3 組凋亡細(xì)胞經(jīng)過統(tǒng)計結(jié)果分析（每組 n > 8），可見 RNAi 組可以誘發(fā) 30% ~ 35%細(xì)胞凋亡，經(jīng)過 PI 和 Annexin-V 染色可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開，熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡（圖1）。

表 1 survivin-siRNA 對裸鼠移植人肺腺癌 A549 細(xì)胞移植瘤的抑制效果

表 2 不同分組移植人肺腺癌 A549 裸鼠腫瘤的體積變化

A：空白對照組；B：空白病毒載體組；C：RNAi 組

Figure 1 Human lung adenocarcinoma A549 cell line observation by PI staining

圖 2 3 組人肺腺癌 A549 細(xì)胞系流式細(xì)胞儀分析的組方圖及散點圖

Figure 2 Three groups human lung adenocarcinoma A549 cell line flow cytometry analysis with histogram ang scatter diagram lung adenocarcinoma A549 cell lines (%)

表 3 3 組腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期分布比例（%）

2.3 細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期分布的觀察

空白對照組和空白病毒載體組細(xì)胞周期分析可見標(biāo)準(zhǔn)的 G1/G0 期二倍體峰和正在分裂增殖的 G2/M期和 S 期四倍體峰，沒有明顯的凋亡亞二倍體峰。RNAi 組，用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片后，在 PI 熒光直方圖上，敲減 survivin 基因后可見凋亡細(xì)胞產(chǎn)生，在 G1/G0 期前出現(xiàn)一亞二倍體峰（圖 2、表 3）。

3 討論

本研究通過構(gòu)建人 survivin 的 siRNA 及其慢病毒表達(dá)載體，裸鼠肺腺癌組織局部注射后，無論從腫瘤的質(zhì)量還是體積上均有顯著變化，同時在基因和蛋白水平上亦有一定程度降低，并且利用流式細(xì)胞儀技術(shù)和 PI 染色檢測到由于 survivin 基因的抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡逐漸增多，出現(xiàn)了典型的亞二倍體峰，且 30% ~ 35%的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡。研究中我們發(fā)現(xiàn) survivin 的過度表達(dá)與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是其治療重要的靶基因。實驗表明 survivin-siRNA 對裸鼠體內(nèi)移植的人肺腺癌 A549 具有明顯抑瘤活性，并且隨著腫瘤生長時間延長一次給予的 survivin-siRNA 對腫瘤的抑制作用逐漸減弱。這可能與腫瘤伴隨有多個癌基因激活和抑癌基因失活，使正常細(xì)胞不斷增生、轉(zhuǎn)化等因素有關(guān)，單獨抑制 survivin 尚不能完全消除腫瘤，說明 RNAi 在體內(nèi)實驗中同樣亦有降解的代謝途徑，這點與文獻(xiàn)報道相符[10-14]，延長其在體內(nèi)的作用時間是下一步研究需要解決的問題。與其他載體相比慢病毒載體用于體內(nèi)實驗更有優(yōu)勢，已有文獻(xiàn)證實[15-17]慢病毒載體作為基因治療工具無論在體外實驗還是體內(nèi)實驗均已獲得初步成功。但隨著實驗的進(jìn)行還發(fā)現(xiàn)伴隨時間的細(xì)胞周期分析結(jié)果中，survivin 表達(dá)阻斷后，G1 期細(xì)胞比例升高，S 期、G2/M 期細(xì)胞相對減少，這與 survivin 在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用一致。survivin 基因表達(dá)沉默后，細(xì)胞增殖抑制及克隆形成能力的下降，不僅源于細(xì)胞凋亡增多，而與 survivin 驅(qū)動細(xì)胞快速分裂作用的喪失密切相關(guān)。通過我們的實驗發(fā)現(xiàn)尚需對 RNAi 作為基因治療手段從不同濃度水平的 siRNA 以及不同給與時間進(jìn)行深入研究，總之，survivin 基因的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是理想的腫瘤治療的靶分子，而慢病毒作為載體的 RNAi 技術(shù)則是抑制腫瘤基因表達(dá)的有效工具，本研究將兩者結(jié)合，有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)增殖，成功誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而為特定類型腫瘤的基因治療提供了新的思路。

[1] Downward J. RNA interference. BMJ, 2004, 328(7450):1245-1248.

[2] Corey DR. Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? J Clin Invest, 2007, 117(12):3615-3622.

[3] An LF, Dong Z. RNA interference-Cancer research new means. ChinJ Oncol, 2005, 27(7):385-388. (in Chinese)

安立峰, 董震. RNA干擾—腫瘤研究的新工具. 中華腫瘤雜志, 2005, 27(7):385-388.

[4] Li F, Brattain MG. Role of the Survivin gene in pathophysiology. Am J Pathol, 2006, 169(1):1-11.

[5] Chen YQ, Li W, Zhou JH, et al. Molecular mechanism of anti-apoptotic action of survivin in NCI-H446 lung cancer cells. Chin J Oncol, 2006, 28(6):413-417. (in Chinese)

陳余清, 李偉, 周繼紅, 等. survivin抗肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.中華腫瘤雜志, 2006, 28(6):413-417.

[6] Blanc-Brude OP, Mesri M, Wall NR, et al. Therapeutic targeting of the survivin pathway in cancer: initiation of mitochondrial apoptosis and suppression of tumor-associated angiogenesis. Clin Cancer Res, 2003, 9(7):2683-2692.

[7] Giard DJ, Aaronson SA, Todaro GJ, et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. J Natl Cancer Inst, 1973, 51(5):1417-1423.

[8] Zhang JT. Modern Experimental Method in Pharmacology. Volume 1. Beijing: Peking Union Medical College, Beijing Medical University Joint Publishing House, 1998:927. (in Chinese)

張均田. 現(xiàn)代藥理實驗方法. 上冊. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1998:927.

[9] Liu ZY, Wang DC, Fu ZD, et al. Experimental study on antitumor efects of shen qi jin kang (SQJK). Chin J Cancer, 2006, 25(8):983- 989. (in Chinese)

劉朝陽, 王德昌, 付招娣, 等. 參芪金康膠囊抗腫瘤作用的實驗研究. 癌癥, 2006, 25(8):983-989.

[10] Singer O, Marr RA, Rockenstein E, et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model. Nat Neurosci, 2005, 8(10):1343-1349.

[11] Yang G, Huang C, Cao J, et al. Lentivirus-mediated shRNA interference targeting STAT3 inhibits human pancreatic cancer cell invasion. World J Gastroenterol, 2009, 15(30):3757-3766.

[12] Oliveira S, Storm G, Schiffelers RM. Targeted delivery of siRNA.J Biomed Biotechnol, 2006, 2006(4):63675.

[13] Liu T, Brouha B, Grossman D. Rapid induction of mitochondrial events and caspase-independent apoptosis in Survivin-targeted melanoma cells. Oncogene, 2004, 23(1):39-48.

[14] Connell CM, Colnaghi R, Wheatley SP. Nuclear survivin has reduced stability and is not cytoprotective. J Biol Chem, 2008, 283(6):3289- 3296.

[15] Chen D, Huang H, Pan C, et al. Antitumor effects of targeting hTERT lentivirus-mediated RNA interference against KB cell lines. Oncol Res, 2009,17(11/12):621-630.

[16] Ravet E, Lulka H, Gross F, et al. Using lentiviral vectors for efficient pancreatic cancer gene therapy. Cancer Gene Ther, 2009.

[17] Goverdhana S, Puntel M, Xiong W, et al. Regulatable gene expression systems for gene therapy applications: progress and future challenges. Mol Ther, 2005, 12(2):189-211.

Lentivirus targeted to anti-lung adenocarcinoma nude mice of carrying survivin siRNA

SI Lei, ZHAO Qi-gang, LIU Zhao-yang, ZHANG Wei

Author Affiliations: The Peoples Hospital of Liaocheng City in Shandong province, liaocheng 252000, China (SI Lei, ZHAO Qi-gang); Cancer Institute/hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China (LIU Zhao-yang, ZHANG Wei)

To explore tumor inhibition of human lung adenocarcinoma nude mice by the lentiviral vectors mediate siRNA for survivin gene.

Referencing siRNA design strategy to construct expression of survivin-siRNA lentiviral vector; we in all BALB / C nude mice inoculated human lung adenocarcinoma A549 cell suspension into subcutaneously of the right armpit. Human lung adenocarcinoma A549 nude mice model was constructed, and the lentiviral vectors were local injected in tumor tissue. Then the curve about the changing of tumor volume in different time were observed. The histogram of tumor cell cycle and apoptosis were examined by PI and FCM, respectively.

The inhibition rate of human lung adenocarcinoma A549 tumor of lentiviral vector mediated survivin-siRNA in nude mice was 46.07%; 30% ~ 35% by the PI and Annexin-V staining to differentiate between early late apoptotic cells and dead cells. Apoptosis of tumor cells were observed under fluorescence microscopy. G1 phase cells significantly increased, S phase cells were decreased significantly.

The lentiviral vectors mediated siRNA for survivin can significantly inhibit survivin gene expressand markedly induce the apoptosis of A549 tumor.

RNA, small interfering; Genetic vectors; Lentivirus; Neoplasms, experimental; Survivin

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.007

聊城市科技攻關(guān)計劃資助項目（20070248）

劉朝陽，Email：Liuzhy118@163.com

LIU Zhao-yang, Email: liuzhy118@163.com

2009-11-12