李亞玲，李景富，康立功，張 賀，董曉慧，許向陽*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院，黑龍江 綏化 152052）

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）是指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%[1-2]，其中包括單堿基的轉(zhuǎn)換（包括C與T轉(zhuǎn)換，在其互補(bǔ)鏈上則為G與A互換）、顛換（包括C與A、G與T、C與G，A與T互換），以及單堿基的插入/缺失等。通常所說的SNP并不包括后兩種情況，轉(zhuǎn)換的發(fā)生率也總是明顯高于其他幾種變異，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而成為胸腺嘧啶[3-4]。SNP被稱為繼限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymor-phisms,RFLP）以及微衛(wèi)星多態(tài)性（Micro-satellite polymorphisms）等標(biāo)記之后的第三代分子標(biāo)記。

SNP檢測(cè)分析技術(shù)目前主要有陣列雜交分析（Array hybridization assays），基因芯片技術(shù)（Gene chips），同源雜交（Homogenous hybridization），限制性酶切法，直接測(cè)序法（Direct sequencing）。直接測(cè)序檢測(cè)SNP的基本原理是：通對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達(dá)100%[5]，本試驗(yàn)中的SNP位點(diǎn)即通過直接測(cè)序法獲得。

SNP分型是SNP研究領(lǐng)域的重要課題。根據(jù)不同研究需要和試驗(yàn)條件，已建立了不同的分型方法，包括寡核苷酸連接分析[6-7]、質(zhì)譜法以及基于PCR的等位基因特異性 PCR（AS-PCR）等[8]。ASPCR法通過特異引物的巧妙設(shè)計(jì)，PCR對(duì)DNA基因組信息的放大和合適的檢測(cè)方法將不同的SNP基因型分辨開來，具有費(fèi)用低，程序簡(jiǎn)單，易于操作等優(yōu)點(diǎn)，適于中小型研究單位對(duì)較小規(guī)模SNP檢測(cè)[9]。目前，改良的AS-PCR方法已有較多報(bào)道，如片段長度差異等位基因特異性 PCR（FLDASPCR）、四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)等[10-11]。

本研究試圖建立和優(yōu)化適合于番茄Mi-1基因SNP分型的AS-PCR反應(yīng)體系，提高這種分型技術(shù)在番茄SNP分型中的準(zhǔn)確性，為番茄的抗根結(jié)線蟲Mi基因分子標(biāo)記連鎖作圖打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試番茄材料

抗病親本08576、感病親本T431以及08576和T431有性雜交的F2代單株。上述材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供。通過對(duì)這些種質(zhì)根結(jié)線蟲Mi-1基因的序列分析，篩選出候選的SNP位點(diǎn)。

1.1.2 供試試劑

CTAB、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶（均購于IBM公司）；Repel、Binding（北京鼎國生物技術(shù)公司生產(chǎn)）；DNA Marker、dNTP、引物（由上海生工生物工程和大連生物公司合成或生產(chǎn)）；其他試劑如瓊脂糖、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、溴化乙錠、TAE緩沖液等化學(xué)試劑（由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取番茄植株幼嫩葉片，用自來水、蒸餾水沖洗兩遍，用滅菌后的濾紙吸干后，每個(gè)樣本稱取0.2 g裝入1.5 mL離心管中，用液氮速凍后-20℃保存?zhèn)溆?；采用CTAB法對(duì)番茄抗病親本品種08576和感病親本品種T431以及雜交組合的F2代分離群體各單株分別進(jìn)行DNA提取。

DNA濃度和質(zhì)量的測(cè)定：用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，λDNA作為Marker，以檢查DNA濃度；紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的純度，OD260/OD280=1.7～2.0。

1.2.2 等位基因PCR（Allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR）

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)

他們好像不是在分手，為什么這么風(fēng)輕云淡，沒有大吵大鬧，沒有歇斯底里，沒有爭(zhēng)吵推諉，或者他們都在等對(duì)方先說出來，其實(shí)心里早已經(jīng)對(duì)這段感情沒有了信心。

試驗(yàn)采用的是原試驗(yàn)數(shù)據(jù)中一個(gè)位于雙親測(cè)序片段401 bp的A-T型顛換的SNP突變位點(diǎn)，研究采用了2個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)，篩選了3個(gè)引物，除都有1個(gè)共同上游引物外，另外2個(gè)特異下游引物3′末端堿基分別和SNP正常堿基和突變堿基互補(bǔ)，在其3′末端第二或第三堿基分別引入錯(cuò)配堿基增加特異性，引物長度約18～20 bp。用Primer Premier 5軟件和Oligo6軟件相結(jié)合，設(shè)計(jì)Mi基因特異引物，優(yōu)化DNA模板濃度梯度、退火溫度梯度、引物濃度梯度、dNTP濃度梯度、Mg2+濃度梯度，摸索出擴(kuò)增效果最佳的PCR程序。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，10×buffer 2 μL，引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，DNA 模板 1 μL，5 U·μL-1Taq 酶 0.2 μL。程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，（94℃變性1 min，Tm退火1 min，72℃延伸1 min）×35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 SNP基因型檢測(cè)

PCR產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳即可分辨，2個(gè)純合等位基因型僅一對(duì)引物能擴(kuò)增出單一譜帶，同一樣本兩對(duì)特異引物都能擴(kuò)增出產(chǎn)物為雜合型。

2 結(jié)果與分析

2.1 提高SNP特異性的引物設(shè)計(jì)與篩選

引物3′末端堿基與模板互補(bǔ)則會(huì)在適合的條件下發(fā)生延伸，否則不能延伸，但是在實(shí)際應(yīng)用中，3′末端單個(gè)堿基錯(cuò)配通常不能阻止擴(kuò)增延伸。因此，Ye等的研究認(rèn)為[12]，在特異引物3′端1、2位加入錯(cuò)配堿基就可以獲得較好的差異產(chǎn)物，并且G/A和C/T錯(cuò)配為強(qiáng)的堿基錯(cuò)配類型；C/A和G/T為弱的堿基錯(cuò)配類型；A/A、C/C、G/G和T/T為中等的堿基錯(cuò)配類型。也就是說：不同嘌呤、不同嘧啶之間的錯(cuò)配分別為強(qiáng)錯(cuò)配，相同嘌呤、相同嘧啶之間的錯(cuò)配分別為中等錯(cuò)配，嘌呤和嘧啶之間的錯(cuò)配為弱錯(cuò)配。在特異引物3′末端錯(cuò)配堿基的搭配方面采取強(qiáng)弱搭配，或者中中搭配，獲得理想擴(kuò)增效果的可能性較大。為了獲得較好的特異性條帶，根據(jù)前人研究經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)針對(duì)母本08576和父本T431分別設(shè)計(jì)了3對(duì)反義鏈引物，這6對(duì)引物共用1對(duì)正義鏈引物。

引物S401-1、S401-2、S401-3與母本08576的SNP位點(diǎn)互補(bǔ)匹配，其中，S401-1的3′端第二位引入A/G強(qiáng)堿基錯(cuò)配，S401-2的3′端第三位點(diǎn)引入C/T類型強(qiáng)錯(cuò)配，S401-3為3′端第二位T/G弱堿基錯(cuò)配類型和第三位點(diǎn)采用C/T強(qiáng)錯(cuò)配類型相結(jié)合。從PCR效果上看可知，引物S401-3的強(qiáng)弱搭配類型表現(xiàn)出了較好的父母本特異帶型（見圖1）。

圖1 與母本08576的SNP位點(diǎn)匹配的等位基因特異引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增Fig.1 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR results of the parent-08576

引物S401-A、S401-B和S401-C與父本T431的SNP位點(diǎn)互補(bǔ)匹配，其中，S401-A的3'端第二位點(diǎn)引入了A/G強(qiáng)錯(cuò)配類型，S401-B的3'端第三位點(diǎn)引入了C/T的強(qiáng)錯(cuò)配類型，S401-C為第二位點(diǎn)T/G弱配和第三位點(diǎn)C/T強(qiáng)配相結(jié)合，但是從PCR效果上看，S401-C在父母本間都擴(kuò)增出了產(chǎn)物，而僅第二位點(diǎn)引入強(qiáng)錯(cuò)配類型的引物S401-A表現(xiàn)出了良好的特異性（見圖2）。

圖2 與父本T431的突變SNP位點(diǎn)匹配的等位基因特異引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增Fig.2 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR rerults of the parent-T431

2.2 AS-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

等位基因特異PCR非常靈敏，其擴(kuò)增效果與PCR反應(yīng)體系中每個(gè)組分的用量以及PCR程序都密切相關(guān)。其中以引物的退火溫度、Mg2+及dNTP濃度的影響較大。在本試驗(yàn)中，先通過引物合成單以及引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5推薦的退火溫度上下5℃設(shè)定梯度，最終確定S401最適溫度為48.2℃，同時(shí)也對(duì)體系中的Mg2+和dNTP濃度進(jìn)行梯度篩選，得到最佳的Mg2+和dNTP濃度。

本研究使用濃度為25 mmol·L-1的Mg2+設(shè)定了5個(gè)梯度分別為1～3 μL，以0.5 μL為間隔梯度。結(jié)果表明，引物S401-3在1 μL時(shí)在兩親本中都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，在2～3 μL時(shí)兩親本中都擴(kuò)增出了產(chǎn)物，但是沒有表現(xiàn)出特異性，而1.5 μL時(shí)在父母雙親中能擴(kuò)增出差異的條帶，且無雜帶；引物S401-A在2～3 μL時(shí)都沒有表現(xiàn)出引物設(shè)計(jì)需要的特異性，而在1 μL和1.5 μL時(shí)能在親本中表現(xiàn)出與S403-3相反的特異性，其中1.5 μL時(shí)條帶更清晰，綜合S403-3的擴(kuò)增情況，選擇單次取25 mmol·L-1的Mg2+1.5 μL時(shí)濃度為最適 Mg2+濃度，即 1.875 mmol·L-1（見圖3、4）。

圖3 等位基因引物S401-3在兩親本間的Mg2+濃度篩選Fig.3 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

圖4 等位基因引物S401-A在兩親本間的Mg2+濃度篩選Fig.4 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

本研究中dNTP濃度也是設(shè)定了5個(gè)梯度分別為1～3 μL，以 0.5 μL為間隔梯度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物S401-3在1.5～2.5 μL時(shí)不能表現(xiàn)出親本間的差異，而在1～3 μL中都表現(xiàn)出了良好的差異；引物S401-A在1.5～3.0 μL都不能表現(xiàn)出親本間的差異，而1 μL時(shí)能表現(xiàn)出與S401-3相反的特異性。從節(jié)約成本的角度出發(fā)，選定單次取2 mmol·L-1的dNTP 1 μL為最適濃度，即100 μmol·L-1（見圖5、6）。

圖5 等位基因引物S401-3在兩親本間的dNTP濃度篩選Fig.5 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

圖6 等位基因引物S401-A在兩親本間的dNTP濃度篩選Fig.6 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

2.3 F2分離群體的SNP分型

利用前面設(shè)計(jì)的等位基因特異引物及其互補(bǔ)引物，在F2分離群體中進(jìn)行PCR，以期獲得帶型相反的PCR產(chǎn)物，即可以相互驗(yàn)證兩對(duì)引物的正確性。又可以檢測(cè)該位點(diǎn)在材料中是哪種純合基因型還是雜合基因型。S401為A/T突變，在親本T431中T/T純合型，在08576中為A/A純合型，因此在F2群體中，僅在S401-3中獲得擴(kuò)增目的片段的為A/A純合型，僅在S401-A中獲得擴(kuò)增目的片段的為T/T純合基因型，同時(shí)在S401-3和S401-A中獲得目的片段的為A/T雜合SNP基因型。由圖7可知，F(xiàn)2分離群體中1、4、9、17為純合的父本基因型T/T型，3、7、13為純合的母本基因型A/A型，其余單株為雜合A/T基因型。單株12為不明原因的缺失。圖7中所示Marker條帶從上到下依次為600、500、400。

圖7 互補(bǔ)引物檢測(cè)SNP基因型Fig.7 Assaying SNP genotypes with complementary primers

試驗(yàn)對(duì) 438個(gè) F2群體進(jìn)行 SNP分型，其中能檢測(cè)出的317株單株的基因型分型結(jié)果如表1所示。另外有121株表現(xiàn)為不明原因的缺失。

表1 F2群體基因型檢測(cè)Table 1 Genotype detection of F2group

查X2值表，當(dāng)自由度為2時(shí)，χ20.05,2=5.991，因此χe2=3.4606＜χ20.05,2，實(shí)際檢測(cè)出的基因分離比與理論分離比1∶2∶1相符合，屬于一對(duì)等位基因的遺傳規(guī)律。

3 討 論

目前國內(nèi)番茄抗病育種在基因工程方面應(yīng)用的技術(shù)主要有AFLP、RAPD、微衛(wèi)星技術(shù)等第一代、第二代分子標(biāo)記[13-15]。而SNP密度高，多態(tài)性豐富，具有高度遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)SNP是一種二態(tài)的標(biāo)記，非此即彼，在檢測(cè)時(shí)無需同檢測(cè)微衛(wèi)星標(biāo)記那樣對(duì)片段的長度做出測(cè)量，只需一個(gè)“+/-”或“全或無”分析的方式，易于分型，有利于快速、自動(dòng)化篩選和檢測(cè)，以及批量、規(guī)模篩選和分析[3]。在連鎖群體遺傳作圖方面，具有作為新一代分子標(biāo)記所特有的價(jià)值和意義。

番茄根結(jié)線蟲病的研究日益重要[16]，根結(jié)線蟲是番茄重要病害之一，在設(shè)施番茄栽培中尤為嚴(yán)重，國外研究報(bào)道相繼指出，番茄根結(jié)線蟲抗性是受一個(gè)顯性基因支配，定名為Mi基因，到目前為止，Mi基因的抗性仍然是目前唯一被鑒定和利用的根結(jié)線蟲抗性，其抗性具有廣譜性，能有效抵抗除北方根結(jié)線蟲以外的其他3種主要根結(jié)線蟲。本研究中采用的SNP位點(diǎn)是通過對(duì)番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因CDS直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)的。

由于AS-PCR比較靈敏，受PCR體系中dNTP、引物、Mg2+等組分濃度以及退火溫度影響較大，若濃度過低，擴(kuò)增弱，易出現(xiàn)假陰性，濃度太高，導(dǎo)致擴(kuò)增非特異性，出現(xiàn)假陽性[10-12]。且不同方法和不同SNP位點(diǎn)對(duì)PCR參數(shù)要求也不一致，所以本研究通過調(diào)整PCR組分濃度或改變PCR程序優(yōu)化PCR效果，獲得最適濃度和最適退火溫度，解決非特異性擴(kuò)增。

在等位基因特異引物設(shè)計(jì)方面，結(jié)合了前人的研究成果，首選了第二、三位引入強(qiáng)錯(cuò)配堿基，以及第二、三中強(qiáng)錯(cuò)配堿基搭配的方法增加獲得較好差異擴(kuò)增的可能，節(jié)約了成本。從這兩個(gè)方面保證了SNP特異擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。不同的SNP類型采用同樣的錯(cuò)配方式設(shè)計(jì)引物得到PCR效果也不盡相同，這可能與引物末端不同錯(cuò)配堿基產(chǎn)生的堿基堆積力、氫鍵及其立體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。還可能與錯(cuò)配堿基對(duì)和DNA聚合酶之間的相互作用造成的空間位阻有關(guān)[17]。為了達(dá)到更好的PCR特異性效果，需要對(duì)不同的堿基錯(cuò)配類型的引物都進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

SNP分型試驗(yàn)是為番茄SNP分子標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)保障；在試驗(yàn)中，利用了SNP的二態(tài)性和便于分型的特點(diǎn)[18]，通過等位基因特異PCR針對(duì)S401位點(diǎn)設(shè)計(jì)的互補(bǔ)的引物對(duì)F2群體進(jìn)行了有效的分型（見圖7），避免了多重PCR反應(yīng)條件復(fù)雜的制約，適用于樣本量適中的分型檢測(cè)，其互補(bǔ)引物相互驗(yàn)證，瓊脂糖電泳即可檢測(cè)，分型設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，可靠。F2群體的SNP分型中，其中已得基因型分離比例經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)符合1∶2∶1的分離比，驗(yàn)證了試驗(yàn)的可靠性，但是還有121株表現(xiàn)為不明原因的缺失，一部分可能是由于DNA降解，另一部分可能由于此位點(diǎn)沒有突變，或是其他不明突變所引起等位基因特異PCR產(chǎn)物無條帶。

4 結(jié)論

研究表明：引入錯(cuò)配堿基和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系可以調(diào)節(jié)PCR擴(kuò)增效果。本試驗(yàn)針對(duì)此位點(diǎn)篩選出了特異性最好的與親本08576的匹配引物S401-3，與親本T431的匹配引物S401-A。并針對(duì)這兩對(duì)等位基因特異引物篩選了最適的PCR反應(yīng)體系為：總體積 20 μL，模板 DNA 1 μL，10×Buffer 2 μL，10 μmmol·L-1引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL。提高了這種分型技術(shù)在番茄SNP分型中的準(zhǔn)確性。

試驗(yàn)對(duì)438株F2群體進(jìn)行了SNP分型，其中317株獲得了基因型，121株由于不明原因缺失，這317株中，表現(xiàn)為母本純合基因型的70株，父母本雜合基因型的175株，父本純合基因型的72株，經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，符合1∶2∶1分離比例，分型結(jié)果可靠，為番茄SNP分子標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)保障。

[1]楊昭慶,洪坤學(xué).單核苷酸多態(tài)性的研究進(jìn)展[J].國外遺傳學(xué)分冊(cè),2000,23(1):4-8.

[2]Landegren U,Nilsson M,Kwok P Y.Reading bits of genetic information:Methods for single nucleotide polymorphism analysis[J].Genome Res,1998,8(8):769-776.

[3]Wang D G,Fan J B,Siao C J,et al.Large-scale identification,mapping,and genotyping of single nucleotide polymorphism in the human genome[J].Science,1998,280:1077-1082.

[4]王淑新,連林生.單核苷酸多態(tài)性作為新一代分子標(biāo)記的優(yōu)越性[J].中國牛業(yè)科學(xué),2008,34(2):40-43

[5]賈玉艷,陳宏.SNP分子標(biāo)記研究及應(yīng)用[J].黃牛雜志,2003,29(1):42-45.

[6]Landegren U,Kaiser R,Sanders J,et al.A ligase-mediated gene detection technique[J].Science,1988,241(4869):1077-1080.

[7]Alves A M,Carr F J.Dot blot detection of point mutations with adjacently hybridising synthe tic oligo-nucleotide probes[J].Nucleic Acids Res,1988,16(17):8723.

[8]Sommer S S,Cassady J D,Sobell J L,et al.A novel method for detecting point mutations or polymorphism and its application to population screening for carriers of phenyl ketonuria[J].Mayo C lin Proc,1989,64:1361-1372.

[9]袁翠平,李英慧,劉章雄,等.一種大豆SNP分型新方法[J].大豆科學(xué),2007,26(4):447-459.

[10]黃代新,楊慶恩,趙貴森.片段長度差異等位基因特異性PCR-一種改良的SNP分型新方法[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(1):11-14.

[11]管峰,艾君濤,楊利國.一種SNP檢測(cè)新方法:四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)[J].生命的化學(xué),2004,24(6):514-516.

[12]Ye S,Dhillon S,Ke X,et al.An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms[J].Nucleic Acids Res.2001,29(17):E88-8.

[13]李景富,趙凌俠,許向陽,等.番茄屬(Lycopersicon)基因組DNA遺傳多樣性RAPD分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,35(1):11-16.

[14]雷娜,李景富,李燁,等.番茄AFLP技術(shù)體系的優(yōu)化和建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(3):29-33.

[16]李紅雙.番茄抗根結(jié)線蟲病基因的分子標(biāo)記研究[D].哈爾濱∶東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[17]衛(wèi)波.小麥抗旱相關(guān)基因TaDREB1[D].楊凌∶西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

[18]Zhang W,Gianibelli M C,Ma W,et al.Identification of SNPs and development of allele-specific PCR markers for gamma-gliadin alleles in Triticum aestivum[J].Theor Appl Genet,2003,107(1):130-138.