陳禹興，付連雙，王曉楠，李卓夫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

全球氣候的變暖為高緯度地區(qū)冬小麥的種植提供了條件，上個(gè)世紀(jì)90年代國家開展冬麥北移項(xiàng)目以來，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開展冬麥的育種工作，東農(nóng)024品系2007年經(jīng)黑龍江品種審定委員會(huì)審定命名為東農(nóng)冬麥1號(hào)，該品種能在黑龍江省冬季積雪較多的北部和東部種植，在冬季積雪較少的西部種植風(fēng)險(xiǎn)很大，因此要求育種上必須培育出抗寒性更強(qiáng)，適應(yīng)范圍更廣的冬小麥新品種[1-3]。目前，冬小麥安全越冬受兩個(gè)因素限制，一是越冬期的低溫傷害；二是返青期倒春寒的傷害。

從返青開始到起身之前，歷時(shí)約1個(gè)月，屬苗期階段的最后一個(gè)時(shí)期，稱返青期，倒春寒是指3月下旬至4月氣溫持續(xù)回升，突遭寒流襲擊，氣溫急劇下降到0℃以下的氣候現(xiàn)象。在黑龍江這種高寒地區(qū)，倒春寒更是頻繁出現(xiàn)。此時(shí)黑龍江省的冬小麥正處于返青起身的關(guān)鍵時(shí)期，抗寒性相對(duì)較弱，比較容易受凍。寒流過后氣溫急劇上升，冬麥幼苗在很短時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷了氣溫“回升-急劇下降-急劇升高”的過程，原本受凍的細(xì)胞由于溫度回升過快其受損程度進(jìn)一步加重[3-4]。本試驗(yàn)擬通過自然低溫馴化后的不同負(fù)積溫冷凍處理，以及在冷凍處理恢復(fù)生長后給予不同的低溫脅迫，對(duì)不同抗寒性的冬麥品種進(jìn)行細(xì)胞膜透性和膜脂過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量比較研究，探討恢復(fù)生長后冬麥植株體內(nèi)細(xì)胞膜透性和丙二醛含量的變化規(guī)律與抗寒性之間的關(guān)系，為寒地冬小麥返青期抗寒性的生理基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗寒性存在顯著差異的東農(nóng)冬麥1號(hào)（返青率為78%，DN1）、024-4（返青率為79%）、03-528（返青率為 54%）及濟(jì)麥 22（返青率為 0%，JM22）四個(gè)品種為材料。供試材料于2009年9月10日播種。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)處理

采用塑料方盒種植冬小麥品種，方盒規(guī)格為550 mm×400 mm×200 mm。在露天自然條件下進(jìn)行低溫馴化。盆中土壤為細(xì)篩過的黑壤土，土層深度15 cm，土壤水分為最大持水量的70%。每盆土壤施入氮、磷、鉀純量分別為3、3.6和1.5 g。采用的肥料為尿素、二銨和硫酸鉀。每盆種植150株，每品種每處理種植3盆。

根據(jù)不同冬麥區(qū)冬季負(fù)積溫適應(yīng)性，共設(shè)置120、240和480℃3個(gè)冷凍負(fù)積溫處理。當(dāng)負(fù)積溫累積到這3個(gè)溫度點(diǎn)時(shí)，分別取回4份供試材料，并置于當(dāng)日相同溫度下平衡72 h。隨后由各平衡溫度開始進(jìn)行升溫處理。升溫處理分為兩個(gè)階段，自平衡溫度以2℃·h-1，升溫至-7℃后，再以1.5℃·h-1升溫至5℃。5℃平衡48 h后，置于12～14℃室溫下使其恢復(fù)生長10 d后取樣。

恢復(fù)生長后的低溫程序：模擬返青期倒春寒的溫度變化對(duì)恢復(fù)生長10 d后的供試材料進(jìn)行低溫脅迫處理。降溫以2℃·h-1的速度進(jìn)行，詳細(xì)溫度處理如下：

1.2.2 膜透性的測(cè)定

采用電導(dǎo)法測(cè)定[5]。取分蘗節(jié)0.2 g，切薄片，置于20 mL燒杯中。加入10 mL去離子水后，用塑料膜封住瓶口，用針頭在塑料膜上均勻刺20個(gè)小孔，將這些小燒杯放入真空器中抽真空15 min。抽真空后將燒杯在室溫下放入振蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h，測(cè)定其電導(dǎo)率（S1），然后將燒杯放入沸水浴中15 min，殺死分蘗節(jié)組織，取出冷卻至室溫，并在室溫下在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩10 min，測(cè)定其電導(dǎo)率（S2）。相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算公式：S1/S2。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

參照趙黎芳等方法[6]。取1.5 mL粗提液A，加入2.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸（用5%三氯乙酸溶解定容）的溶液?；旌衔锓兴?0 min，冷卻后再離心一次分別測(cè)定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值，并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量（μmol·g-1）。

計(jì) 算 公 式 ：C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450

式中，A532、A600、A450分別代表450、532和600 nm波長下的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對(duì)電導(dǎo)率的變化

逆境會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，膜透性增大，因此可以測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率來反映逆境對(duì)植物組織傷害的程度[7]。越冬期間東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528品系和024-4品系3個(gè)品種（系）的相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的降低而逐漸升高。濟(jì)麥22相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的下降表現(xiàn)為先下降后大幅升高的趨勢(shì)。東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系3個(gè)品種（系）在負(fù)積溫120℃和240℃下卻沒有明顯差異，負(fù)積溫240℃到480℃處理下，濟(jì)麥22上升幅度顯著高于其他3個(gè)品種（系），這說明與其他3個(gè)品種（系）相比，濟(jì)麥22的相對(duì)電導(dǎo)率在低溫脅迫時(shí)受溫度影響較大。在480℃負(fù)積極溫處理中濟(jì)麥22的相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到0.6，與其他品種相比差異極顯著，受低溫傷害嚴(yán)重。在負(fù)積溫為480℃時(shí)，濟(jì)麥的相對(duì)電導(dǎo)率高于0.5，表明此時(shí)濟(jì)麥22已經(jīng)死亡[7]。結(jié)果見圖1）。比較各品種在恢復(fù)生長后經(jīng)受低溫脅迫時(shí)，不同品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖2。

在不同冷凍負(fù)積溫處理中，相對(duì)電導(dǎo)率均隨著處理溫度的降低而升高。120℃負(fù)積溫處理中，其中濟(jì)麥22在-6℃和-9℃低溫脅迫時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升，達(dá)到0.69和0.71，較-3℃脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率增幅為70%；東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系3個(gè)品種（系）雖有上升但是上升幅度較緩。240℃的負(fù)積溫處理中，東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系恢復(fù)生長后，在-3℃和-6℃兩個(gè)處理溫度下品種（系）相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著，而經(jīng)受-9℃低溫脅迫時(shí)顯著上升，其中以024-4上升幅度最大。480℃負(fù)積溫處理中，恢復(fù)生長后植株相對(duì)電導(dǎo)率隨著低溫脅迫的加劇而上升，03-528品系顯著高于東農(nóng)冬麥1號(hào)和024-4品系。這說明隨著冷凍負(fù)積溫的積累，各品種恢復(fù)生長后對(duì)低溫脅迫的敏感度增加。03-528品系對(duì)低溫的敏感度比東農(nóng)冬麥1號(hào)和024-4品系兩個(gè)品種（系）高。

比較在不同負(fù)積溫冷凍處理后恢復(fù)生長的植株在經(jīng)受相同低溫脅迫處理時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的變化，結(jié)果見圖3～6。未經(jīng)受低溫脅迫時(shí)，不同負(fù)積溫冷凍處理后恢復(fù)生長的植株相對(duì)電導(dǎo)率差異不明顯；-3℃低溫處理下，負(fù)積溫240℃冷凍處理恢復(fù)生長后，各品種的相對(duì)電導(dǎo)率略低于另兩個(gè)處理。在-6℃低溫脅迫下，負(fù)積溫120℃相對(duì)電導(dǎo)率高于另兩個(gè)處理，處理內(nèi)，濟(jì)麥22相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他品種（系）。在-9℃低溫脅迫下，負(fù)積溫120℃冷凍處理恢復(fù)生長后，濟(jì)麥22高于其他品種，負(fù)積溫240℃時(shí)，冬麥1號(hào)、024-4、03-528的相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著，負(fù)積溫480℃時(shí)，只有03-528的電導(dǎo)率有所升高，冬麥1號(hào)和024-4升高不顯著。由此可以看出，適當(dāng)?shù)呢?fù)積溫積累可以在一定范圍內(nèi)提高細(xì)胞膜對(duì)滲透脅迫的抗性。

2.2 丙二醛（MDA）含量的變化

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，通常以MDA含量作為膜脂過氧化反應(yīng)的主要指標(biāo)，MDA含量的多少體現(xiàn)了細(xì)胞膜被破壞的程度[8]。由圖7可以看出，負(fù)積溫為120℃時(shí)濟(jì)麥22品種的MDA含量顯著高于東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528品系和024-4品系3個(gè)品種（系）。

圖7 負(fù)積溫處理下不同抗寒性冬小麥分蘗節(jié)中丙二醛含量變化Fig.7 Change of MDA content in tillering nodes of different cold resistance winter wheat in negative accumulated temperature treatment

隨著負(fù)積溫的增加，東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528品系的MDA含量升高，而濟(jì)麥22、024-4品系的含量卻下降。負(fù)積溫240℃時(shí)，濟(jì)麥22的MDA含量仍然高于其他品種（系），024-4品系的MDA含量顯著低于其他品種。負(fù)積溫480℃下，東農(nóng)冬麥1號(hào)、濟(jì)麥22、03-528品系的MDA含量較負(fù)積溫240℃時(shí)略有下降，024-4品系的MDA含量上升，4個(gè)品種（系）之間差異不顯著。

比較分析各品種在冷凍處理恢復(fù)生長后經(jīng)受低溫脅迫時(shí)，不同品種的MDA含量變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖8。負(fù)積溫120℃冷凍處理的植株恢復(fù)生長，濟(jì)麥22丙二醛含量高于東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528品系和024-4品系，在未經(jīng)受低溫脅迫和經(jīng)受-9℃脅迫時(shí)這種差異最顯著。各品種未經(jīng)受低溫脅迫時(shí)MDA含量最低，-3℃和-6℃脅迫下的各品種MDA含量差異不顯著，濟(jì)麥22和03-528品系在-6℃脅迫下的MDA含量相比-3℃脅迫分別下降 0.4 和 0.56 μmol·g-1。-9 ℃脅迫下各品種MDA含量顯著上升，其中濟(jì)麥22上升到7.12 μmol·g-1增幅最大，為73.34%。負(fù)積溫240℃冷凍處理的植株恢復(fù)生長后，03-528品系的MDA含量在不同溫度低溫脅迫中均高于東農(nóng)冬麥1號(hào)、024-4品系。-6℃脅迫處理下各品種的MDA含量較-3℃和-9℃脅迫處理的含量有所降低。負(fù)積溫480℃冷凍處理的植株恢復(fù)生長后，東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系3個(gè)品種（系）之間的MDA含量差異比前兩個(gè)處理品種間差異小，且在-6℃低溫脅迫下各品種的MDA含量最低。通過以上分析可以得出，抗寒性弱的品種在低溫下MDA含量較高，而不同返青處理的植株-6℃低溫脅迫下的MDA含量較其他低溫處理時(shí)低。

進(jìn)一步分析不同冷凍處理恢復(fù)生長的冬麥植株在經(jīng)受相同低溫脅迫處理時(shí)MDA含量的變化，結(jié)果見圖 9～12。

由圖9可知，在未接受低溫處理時(shí)，負(fù)積溫120℃冷凍處理的植株恢復(fù)生長后，濟(jì)麥22的MDA含量最高，隨著冷凍處理溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系的MDA含量普遍增加，東農(nóng)冬麥1號(hào)和03-528在冷凍負(fù)積溫480比240℃處理低。由圖10可知，-3℃低溫脅迫時(shí)，負(fù)積溫240℃冷凍處理恢復(fù)生長的東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系3個(gè)品種（系）的MDA含量高于另外兩個(gè)返青溫度處理，其中03-528品系差異最顯著；負(fù)積溫480℃冷凍處理恢復(fù)生長后，各品種（系）MDA含量為冷凍處理中最低。由圖11可知，在-6℃低溫脅迫下，隨著返青起始溫度的下降各品種（系）MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；各起始溫度處理內(nèi)部MDA含量差異較小。由圖12可知，在-9℃低溫脅迫下，負(fù)積溫120℃冷凍處理恢復(fù)生長后，濟(jì)麥22品種MDA含量最高。不同的低溫脅迫下，濟(jì)麥22和03-528品系的MDA含量普遍高于東農(nóng)冬麥1號(hào)和024-4品系。

3 討 論

3.1 相對(duì)電導(dǎo)率的的變化

質(zhì)膜是細(xì)胞與環(huán)境之間的界面，各種逆境對(duì)細(xì)胞的影響首先作用于質(zhì)膜，而逆境脅迫對(duì)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能的影響通常表現(xiàn)為選擇性的喪失，電解質(zhì)和某些小分子有機(jī)物質(zhì)大量滲漏，從而引起相對(duì)電導(dǎo)率的上升[9]。

本試驗(yàn)中，抗寒性較高的東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系在越冬期間相對(duì)電導(dǎo)率隨著負(fù)積溫的積累有所上升，但上升幅度顯著低于抗寒性弱的濟(jì)麥22。當(dāng)負(fù)積溫累積到480℃時(shí)，濟(jì)麥22相對(duì)電導(dǎo)率大幅度上升，達(dá)到0.6，說明此時(shí)濟(jì)麥22植株受凍害嚴(yán)重，甚至于死亡。不同負(fù)積溫處理的植株返青后，在低溫脅迫下隨著脅迫溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率均有不同幅度升高，抗寒性弱的品種升高幅度較大。在-9℃低溫脅迫時(shí)東農(nóng)冬麥1號(hào)、03-528和024-4品系的相對(duì)電導(dǎo)率均接近0.5，這說明在-6℃至-9℃低溫脅迫之間可能具有植株耐受低溫的臨界值。值得注意的是，-3℃和-6℃低溫脅迫下，240℃負(fù)積溫返青處理中各品種的電導(dǎo)率值比其他兩個(gè)負(fù)積溫處理的電導(dǎo)率值低，這說明一定程度上的負(fù)積溫的積累可以提高植株的抗寒性。但隨著負(fù)積溫的逐步累積，低溫對(duì)植株造成傷害有所加深。

3.2 MDA含量的變化

MDA作為膜脂過氧化終產(chǎn)物，對(duì)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能都具有較顯著影響。MDA不僅能與蛋白結(jié)合從而引起生物膜中結(jié)構(gòu)蛋白和酶的聚合并使它們的結(jié)構(gòu)功能和催化功能發(fā)生改變，還可以降低膜中不飽和脂肪酸的含量，從而降低膜流動(dòng)性[10]。很多研究都證實(shí)，當(dāng)MDA含量積累到一定程度時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率會(huì)顯著上升[11-12]。Simon指出膜脂過氧化引起膜透性增加的直接原因可能是磷脂性質(zhì)的改變，間接原因可能是膜蛋白在過氧化過程中受到傷害。

本試驗(yàn)中，當(dāng)負(fù)積溫積累到240℃時(shí)，東農(nóng)冬麥1號(hào)和03-528品系的MDA含量升高，而濟(jì)麥22和024-4品系的含量卻下降。此時(shí)，濟(jì)麥22的MDA含量仍然高于其他品種，而024-4品系的MDA含量顯著低于其他品種。濟(jì)麥22品種的MDA含量的變化可能是由于11月初氣溫突然下降，從而導(dǎo)致越冬初期抗寒性較弱的濟(jì)麥22膜系統(tǒng)受損并隨著溫度的逐漸穩(wěn)定而有所恢復(fù)。說明濟(jì)麥22在遭遇突然降溫的情況下，膜脂過氧化反應(yīng)比其他品種劇烈。024-4品系的MDA含量變化的原因不明，還有待進(jìn)一步研究。在不同負(fù)積溫返青處理之間，480℃負(fù)積溫處理中各品種（系）在不同低溫脅迫下均表現(xiàn)出較低的丙二醛含量水平?？梢酝茰y(cè)，越冬期負(fù)積溫的累積對(duì)膜脂抗氧化具有積極意義。還有一點(diǎn)值得關(guān)注的是，無論120℃、240℃，還是480℃負(fù)積溫的返青處理，給予-3℃、-6℃和-9℃三個(gè)低溫處理后，丙二醛含量均表現(xiàn)為-6℃處理下最低，顯著低于-3℃和-9℃低溫處理下的丙二醛含量，這點(diǎn)與不同負(fù)積溫起始低溫處理下電導(dǎo)率的變化結(jié)果一致，由此可以得出，冬小麥分蘗節(jié)對(duì)返青期低溫也有一個(gè)適應(yīng)過程，經(jīng)過-3℃低溫脅迫下，抗寒性有所增強(qiáng)，在-6℃低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜也有所恢復(fù)，但是進(jìn)一步的低溫，又會(huì)導(dǎo)致膜脂過氧化的加劇。

4 結(jié) 論

伴隨著植物恢復(fù)生長后低溫脅迫的加劇，MDA含量呈上升趨勢(shì)，細(xì)胞膜透性增大，相對(duì)電導(dǎo)率相應(yīng)增加。因此，丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率可在一定程度上反映冬小麥品種抗寒性的強(qiáng)弱。不同抗寒性冬麥品種（系）植株恢復(fù)生長后，在低溫脅迫下仍表現(xiàn)出顯著差異，抗寒性強(qiáng)的品種（品系）質(zhì)膜的穩(wěn)定性大于抗寒性弱的品種（系）。恢復(fù)生長的冬小麥對(duì)低溫也有適應(yīng)的過程，-3℃低溫脅迫下，抗寒性加強(qiáng)，-6℃細(xì)胞膜有所恢復(fù)，進(jìn)一步的低溫，則膜脂過氧化加劇。

[1]于晶,周子珊,牟永潮,等.低溫下不同抗寒性冬小麥葉片組織結(jié)構(gòu)比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(4):7-11.

[2]于晶,孟健男,曾儼,等.溫度及土壤含水量對(duì)冬小麥生長習(xí)性及返青率的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(5):9-13.

[3]陳儒鋼,鞏振輝,逯明輝.植物抗寒基因工程研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(6):1274-1280.

[4]萬富世.冬小麥品種越冬性改良理論與實(shí)踐[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2006:43.

[5]高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安:世界圖書出版社,2000:35.

[6]趙黎芳,張金政,張啟翔.鹽和水分預(yù)處理對(duì)扶藤幼苗抗寒性的影響[J].植物研究,2004,24(3):313-316.

[7]鞏振輝.作物育種學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,2007:45.

[8]劉艷陽,李俊周,陳磊,等.群低溫脅迫對(duì)小麥葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及相關(guān)酶活性的影響[J].麥類作物學(xué)報(bào),2006,26(4):70-73.

[9]陳少裕.膜脂過氧化對(duì)植物細(xì)胞的傷害[J].植物生理學(xué)通訊,1991,27(2):84-90.

[10]王連敏,王立志,張國民,等.苗期低溫對(duì)玉米體內(nèi)脯氨酸電導(dǎo)率及光合作用的影響[J].中國農(nóng)業(yè)氣象,1999,20(2):28-30.

[11]Dobretsov G E,Borschevskaya T A,Petrov V A,et al.The increase of phospholipid bilayer rigidity after lipid peroxidation[J].FEBS Letters,1977,84:195.

[12]周龍,廖康,王磊,等.低溫脅迫對(duì)新疆野生櫻桃李電解質(zhì)滲出率和丙二醛含量的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(1):47-50.

[13]Simon E W.Phospholipids and plant membrane permeability[J].New Phytol,1974,73:377.