王紹鵬，劉尚武，李 勇，劉偉婷，呂典秋

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

微衛(wèi)星序列又稱簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）標記具有數(shù)量豐富、周期短、不受環(huán)境條件影響，高度多態(tài)性、共顯性及復(fù)等位性,試驗重復(fù)性好、結(jié)果可靠性高等優(yōu)點[1-2]，該技術(shù)克服了形態(tài)學(xué)標記、蛋白質(zhì)及同工酶等鑒定技術(shù)的缺點和不足，成為一種極具實用價值的標記方法。應(yīng)用SSR標記在甜瓜、黃瓜、砂梨等方面已經(jīng)開展了研究[3-5]。

多重PCR（Multiplex PCR）技術(shù)是指在一個單一反應(yīng)體系中加入一對以上的特異引物對，同時擴增多個序列，從而產(chǎn)生高度特異性的反應(yīng)過程[6]，該技術(shù)能夠適應(yīng)高通量DNA指紋分析的需要，節(jié)省DNA模板和試驗耗材，簡化操作步驟，加速試驗進程[7]。目前，對多重PCR體系優(yōu)化的策略和步驟已有大量相關(guān)的研究和報道[8-11]，但在馬鈴薯作物中，尚無人開展這方面的研究。

本研究對影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵因素（模板DNA的純度和濃度、引物的質(zhì)量和特異性、Taq酶的用量及dNTPs的濃度等）進行了優(yōu)化分析，建立多重PCR反應(yīng)體系最佳模型，以期在馬鈴薯品種純度鑒定應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，并為馬鈴薯品種遺傳多樣性分析，建立馬鈴薯品種DNA指紋圖譜奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用的馬鈴薯品種保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所品種資源庫，品種信息見表1，多重PCR擴增所用引物由加拿大蒙特利爾麥吉大學(xué)科研組提供，并由上海生工生物技術(shù)公司合成（引物序列信息見表2），其他試劑均購自大連寶生物試劑公司。

表1 黑龍江省馬鈴薯主栽品種Table 1 Main potato varieties in Heilongjiang Province

表2 試驗用引物序列Table 2 Primer sequence in experiment

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯基因組DNA的提取

采用DNA提取緩沖液（Isolation buffer）提取馬鈴薯DNA。

Isolation buffer提取液配方如下：100 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、 50 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）、 1.3 mol·L-1NaCl、0.2%SDS、0.5%Triton X-100、1%PVP、10 mmol·L-1DTT、60 mmol·L-1β-mercaptoethanol，其他操作步驟同一般SDS提取方法。將提取的DNA樣品用ddH2O稀釋到60 ng·μL-1后，置于-20℃保存。

DNA質(zhì)量測定：將提取到的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳， 0.5 μg·mL-1溴化乙錠（Ethidium bromid，EB）染色，Alpha Innotech公司的December2006型紫外凝膠成像儀檢測結(jié)果，并用Thermo公司的NANODROP1000型紫外分光光度計測量DNA純度和濃度。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系

基礎(chǔ) PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：10×PCR 緩沖液2 μL， 10 mmol·L-1dNTP 0.6 μL， 25 mmol·L-1MgCl21.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.1 μL，4 mmol·L-1上游引物 1 μL，4 mmol·L-1下游引物1 μL（共4對），滅菌雙蒸水 6.8 μL，DNA 模板 60 ng。

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，48.5℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min，產(chǎn)物4℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：取PCR產(chǎn)物5 μL，與1 μL 6-Loading Buffer混勻，用12%的聚丙烯酰胺凝膠，在160 V電壓下進行電泳，當指示劑二甲苯腈遷移至距電泳槽底部1 cm時停止電泳，用EB染色，利用凝膠成像儀判讀檢測結(jié)果。

1.2.3 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.2.3.1 體系成分單因素濃度梯度分析

試驗設(shè)計如表3所示。

表3 單因素濃度梯度設(shè)置Table 3 Settings of monofactorial concentration gradient

選用馬鈴薯品種克新18作為試驗品種，在不改變其他成分濃度條件下，分別對PCR反應(yīng)體系的各組分進行濃度或用量梯度試驗，比較不同處理對SSR標記擴增結(jié)果的影響。

1.2.3.2 引物組合正交設(shè)計

為篩選多重PCR反應(yīng)中引物配比的最佳水平，采用正交設(shè)計L9（34）在4因素3水平上進行試驗，設(shè)計方案見表4。

表4 多重PCR引物因素水平L9（34）正交試驗設(shè)計Table 4 Monofactorial L9(34)orthogonal design of multiplex PCR primers (mmol·L-1）

1.2.3.3 PCR退火溫度選擇

在試驗確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，利用Biometra公司TGRADIENT型擴增儀對本次試驗所用引物的退火溫度進行優(yōu)化篩選，設(shè)置退火溫度為43.0～65.0℃，擴增儀自動生成12個梯度擴增。

1.2.4 體系優(yōu)化前后擴增結(jié)果比較

以克新18為試驗材料，比較基礎(chǔ)反應(yīng)體系與優(yōu)化后反應(yīng)體系擴增結(jié)果的差異，每個體系3次重復(fù)。

1.2.5 優(yōu)化體系穩(wěn)定性測試

使用優(yōu)化體系對三個馬鈴薯品種（克新18、荷蘭15、大西洋）進行多重PCR擴增，每個品種兩次重復(fù)，考察優(yōu)化體系的穩(wěn)定性和一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

將提取的馬鈴薯DNA，各取5 μL，與1 μL 6-Loading Buffer混勻，用1%瓊脂糖凝膠，在100 V電壓下，電泳30 min，結(jié)果用紫外凝膠成像儀檢測。從電泳結(jié)果可以看出：用Isolation Buffer提取液提取的馬鈴薯DNA質(zhì)量好，主帶唯一，無拖尾和彌散現(xiàn)象（見圖1），3個樣品的OD260/OD280值均接近于1.8，能夠滿足SSR標記的要求（見表5）。

2.2 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 Mg2+濃度對多重PCR體系擴增的影響

結(jié)果見圖2。其中，Mg2+濃度較低時（1、2泳道），PCR擴增不完全，小分子質(zhì)量的多態(tài)性條帶沒有出現(xiàn)；隨著Mg2+用量的增加（3、4泳道），多態(tài)性條帶數(shù)量也隨之增多，擴增更加完全，條帶基本覆蓋整個泳道；當Mg2+用量過大時（第5泳道），300～400 bp之間的條帶擴增變強，但是240 bp處條帶減弱甚至消失，因此多重PCR反應(yīng)體系中，Mg2+的最佳用量為2.5 μL。

表5 馬鈴薯DNA質(zhì)量分析Table 5 Potato DNA quality analysis

圖1 馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoretogram of potato DNA

圖2 Mg2+濃度對PCR體系擴增的影響Fig.2 Effect of Mg2+concerntration on PCR amplification system

2.2.2 dNTPs濃度對多重PCR體系擴增的影響

結(jié)果見圖3。隨著dNTPs濃度的增大，SSR標記擴增更加完全，條帶數(shù)量增多，如圖3中的2、3、4泳道，條帶數(shù)量均多于第1泳道；當dNTPs用量為1.2 μL時（第5泳道），擴增出的特異性條帶數(shù)量急劇減少，不到5條。所以，從擴增效果和節(jié)約試劑角度考慮，在多重PCR反應(yīng)體系中，dNTPs的最佳用量為0.6 μL。

圖3 dNTPs濃度對PCR體系擴增的影響

2.2.3 模板濃度對多重PCR體系擴增的影響

在本試驗中，模板濃度設(shè)置過低或者過高時均不能得到好的擴增效果，結(jié)果見圖4。其中，1、2泳道小分子質(zhì)量的多態(tài)性條帶基本沒有擴增出來；第5泳道，條帶數(shù)量相對3、4泳道少且不清晰；第4泳道擴增情況最好，多態(tài)性條帶明亮并且數(shù)量豐富，當為模板首選濃度。

圖4 模板濃度對PCR體系擴增的影響Fig.4 Effect of template concerntration on PCR amplification system

2.2.4 Taq酶對多重PCR體系擴增的影響

試驗設(shè)定Taq酶用量為5個梯度，在試驗梯度范圍內(nèi)，總的說來，對多態(tài)性條帶的數(shù)量影響不是很大，差異不明顯，但條帶清晰度差異明顯，在0.8和1.0 U時，條帶清晰度最好，在1.2 U時，條帶清晰度有減弱的趨勢，基于以上分析及從節(jié)約成本的角度看，Taq酶的最佳用量為0.8 U（見圖 5）。

圖5 Taq酶對PCR體系擴增的影響Fig.5 Effect of Taq enzyme on PCR amplification system

2.2.5 引物正交設(shè)計對多重PCR體系擴增的影響

多重PCR體系在正交設(shè)計9種組合的情況下擴增，結(jié)果見圖6。只有第7、8種組合，體系擴增情況不好，泳道多態(tài)性條帶數(shù)量非常少；其余幾種引物組合擴增情況基本相同，條帶數(shù)量多，基本覆蓋了整條泳道，并且明亮、清晰，其中第4泳道的擴增狀況最好，可以做為優(yōu)化引物組合的首選。

2.2.6 退火溫度對多重PCR體系擴增的影響

退火溫度設(shè)置范圍為43.0～65.0℃，擴增儀自動生成12個溫度（見表6）。

圖6 引物正交設(shè)計對PCR體系擴增的影響Fig.6 Impact of primer orthogonal design on PCR amplification system

PCR擴增結(jié)果見圖7。在1～3的溫度下，PCR擴增非常不好，只有200～500 bp的少數(shù)的幾條主亮帶擴增出來；在4～6的區(qū)間，條帶數(shù)量稍有增加，但300～400 bp分子質(zhì)量的條帶沒有擴增出來或者不清晰，100～200 bp之間只有亮帶擴增；7～12區(qū)間，多態(tài)性條帶擴增數(shù)量多，但9～12泳道在164 bp處擴增條帶較弱或沒有擴增；7、8泳道擴增最為完全，從節(jié)約成本的角度選擇，54.7℃為最適退火溫度。

表6 退火溫度梯度Table 6 Gradient of annealing temperature

圖7 退火溫度梯度對PCR體系擴增的影響Fig.7 Effect of annealing temperature gradients on PCR amplification system

2.3 體系優(yōu)化前后擴增結(jié)果比較

結(jié)果見圖8。

圖8 體系優(yōu)化前后擴增結(jié)果比較Fig.8 Comparison of amplification results before and after system optimization

以克新18為試驗材料，進行體系優(yōu)化前后擴增結(jié)果比較?？梢姡w系優(yōu)化前擴增多態(tài)性條帶數(shù)量少，大概為優(yōu)化后體系擴增條帶數(shù)量的一半，在 200、300～400、1 000～1 500 bp 之間的條帶基本沒有擴增（1～3泳道），優(yōu)化后的體系擴增完全，條帶覆蓋整個泳道，增幅效果明顯（4～6泳道）。

2.4 試驗穩(wěn)定性測試

結(jié)果見圖9。

以黑龍江省馬鈴薯主栽品種大西洋、荷蘭15、克新18為試驗材料，進行多重PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定性測試。從圖9的電泳結(jié)果可以看出，同一馬鈴薯品種的2次重復(fù)擴增結(jié)果一致，組內(nèi)的2個平行對照結(jié)果一致。表明所建立的SSR標記多重PCR體系擴增結(jié)果穩(wěn)定，從圖9中還可以看到，不同馬鈴薯品種之間的多態(tài)性條帶數(shù)量、帶型有較大差異，品種能夠明顯區(qū)分。

圖9 試驗穩(wěn)定性測試Fig.9 Stability test

3 討論

近年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，誕生了一系列DNA分子標記技術(shù)，SSR標記在動植物研究方面[12-13]，已成為遺傳連鎖分析、基因定位以及指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域一個極為重要的研究手段，同時也應(yīng)用到品種鑒定的研究中，給作物遺傳育種帶來巨大變化。

多重PCR與單一PCR相比，一次反應(yīng)可以同時檢測多個標記，時間短，所需試劑少，因而高效、快捷又經(jīng)濟；同時在靈敏度上高度特異敏感，保證了擴增結(jié)果的準確性；極大地減少了工作量，在一定程度上加速了試驗進程[14]。因此，針對特定目標，開發(fā)簡單、快速和有效的多重PCR體系對促進馬鈴薯品種純度鑒定及建立馬鈴薯主栽品種指紋圖譜具有重要意義。

多重PCR要求不同引物能在同一反應(yīng)體系中進行特異性擴增，對于試驗的條件要求相對比較嚴格，針對不同作物建立相適應(yīng)的多重PCR反應(yīng)體系，是取得試驗成功的關(guān)鍵[10]，為了保證多個目的片段在1個PCR反應(yīng)中同時特異性擴增，體系優(yōu)化成了構(gòu)建多重組合一個必需的環(huán)節(jié)，因此體系中模板DNA的純度和濃度、引物的質(zhì)量和特異性、Taq聚合酶的用量及dNTP的濃度是對擴增結(jié)果有明顯影響的幾個重要因素[9]。在影響多重PCR反應(yīng)的眾多因素中，引物的兼容性和引物濃度的比例是其中兩個核心因素[10]，引物的兼容性主要原則就是避免引物內(nèi)部形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物及引物之間在擴增過程中產(chǎn)生二聚體，平衡每對引物的濃度使每個座位都能獲得足夠的擴增量，是優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件的關(guān)鍵。該過程需要反復(fù)地試驗,根據(jù)電泳檢測結(jié)果，選擇最合適的各引物的相對比例。同時多重PCR反應(yīng)盡量在同一臺PCR儀或同型號的不同PCR儀上擴增，以保證試驗的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本試驗所用4對引物擴增多態(tài)性條帶分布在不同的范圍，避免了相互之間的拮抗作用，保證了試驗的順利進行。對多重PCR體系之中的相關(guān)影響因素逐一進行了分析，確立了馬鈴薯SSR標記多重PCR體系的優(yōu)化模型，即總體積為 20 μL：25 mmol·L-1MgCl22.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.6 μL，Taq 酶 0.8 U，模板 DNA 80 ng，4 mmol·L-1的 4 對引物之間的用量比為2∶1∶2∶3，引物退火溫度為54.7℃。優(yōu)化后的反應(yīng)體系重復(fù)性好，擴增結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠明顯區(qū)分不同的馬鈴薯品種。本研究為進一步探討馬鈴薯品種資源遺傳多樣性、構(gòu)建DNA指紋圖譜打下了堅實的基礎(chǔ)。

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