田 俊，宋雯雯，韓 雪，高慕娟，楊繼學，王繼安

（大豆生物學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

大豆皂甙（Soyasaponin）是大豆中存在的一類具有較強生物活性的物質，具有較多對人體有益的生理功能，被廣泛的應用于食品加工、醫(yī)藥等方面。但由于大豆皂甙的溶血作用以及對人體粘膜有強烈的刺激作用，也被認為是造成大豆制品帶苦澀味的來源，所以在大豆制品中人們都盡量將其除去，但是隨著對大豆皂甙的多種有利的生理功能的發(fā)現(xiàn)和重新評價，對它的研究逐漸走向熱門。國內(nèi)外已有很多大豆深加工企業(yè)建立生產(chǎn)線從大豆籽粒中連續(xù)提取皂甙和其他大豆生物活性物質，這使得市場上對優(yōu)質特種大豆的原料需求增加。然而，目前對于大豆皂甙的結構、性質、功效、機理等方面的研究報道較多，而對于大豆皂甙專用品種的選育方面的研究較少[1-4]。

本研究分析了大豆雜交后代皂甙含量的遺傳變異規(guī)律，利用SSR分子標記技術，研究與皂甙含量相關的QTLs，為利用分子輔助手段培育高皂甙含量大豆品種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用大豆皂甙含量高的親本哈91016（♀）和大豆皂甙含量低的親本N98-9445A（♂）及二者雜交所得的F2群體中隨機抽取的198個樣本材料。親本于2008年種植于東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地。

1.2 方法

1.2.1 大豆皂甙含量測定

本試驗采用大豆皂甙的甙元類似物齊墩果酸作為標準品的比色法測定大豆皂甙的含量[5]。最佳測定條件：粉碎樣品過60目篩，有機溶劑脫脂后加入70%乙醇水溶液，70℃水浴加熱浸提3.5 h、過濾重復1次，取濾液于40℃旋轉揮發(fā)回收乙醇得皂甙粗提液，再用飽和正丁醇萃取過夜，分離正丁醇相，減壓濃縮呈褐色粘稠狀，加甲醇溶解定容至10 mL，吸取樣品50 μL進行上述香草醛-高氯酸顯色反應，紫外分光光度計測定最大吸收值[5]。

1.2.2 葉片總DNA的提取

采用改進的CTAB法提取葉片總DNA[6]。

1.2.3 SSR反應

SSR引物來源：根據(jù)SoyBase提供的SSR引物序列，由上海博亞生物技術有限公司合成。

PCR反應體系：反應總體積為20 μL。反應液包括2 μL模板DNA（25 ng·μL-1），12.5 μL PCR水，2 μL Buffer，1.5 μL SSR引物（10 mg·μL-1），1.5 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.5 μL Taq酶（5 U·μL-1），液體石蠟覆蓋。

PCR擴增條件：反應在PTC-100TMPeltiter thermal cycle熱循環(huán)儀中進行，95℃預變性5 min，然后進入循環(huán)：94℃變性30 s，47℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)后72℃延伸5 min。產(chǎn)物置于4℃下保存。將PCR反應后的SSR材料每管加上8 μL Loading Buffer，置于PCR儀中95℃變性10 min后取出，放入冰水混合物中冷卻。冷卻后放入4℃冰箱內(nèi)保存，待用。PCR產(chǎn)物以6%聚丙烯酰胺凝膠測序膠為介質，以1×TBE為緩沖液，在100 W恒定功率下電泳約50 min，銀染檢測。電泳儀采用Biorad垂直電泳儀，上樣量為8～10 μL。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將各單株的帶型和親本相應位點的帶型進行比較，與母本類型條帶相同的個體記為“A”，與父本類型條帶相同的個體記為“B”，雜合型記為“H”，缺失的記為“-”。

利用Mapmaker/EXP3.0b軟件進行連鎖分析，用Mapchart2.1作圖軟件構建分子標記連鎖圖譜，QTL分析采用WinQTLCartographer v2.0[7]。

2 結果與分析

2.1 F2群體中皂甙含量的遺傳分布

本試驗對高皂甙含量親本哈91016（♀）、低皂甙含量親本N98-9445A（♂）以及在衍生的F2群體中隨機抽取的198個樣本進行皂甙含量的測定，后代群體的皂甙含量多數(shù)介于雙親之間，少數(shù)存在超親現(xiàn)象。其中最大值達到17.8 mg·g-1，大于母本哈91016（13.6 mg·g-1），表現(xiàn)正向超親的占13.9%，而最小值為 6.7 mg·g-1，小于父本 N98-9445A（8.7 mg·g-1），表現(xiàn)負向超親的占5.2%，說明F2群體皂甙含量具有豐富的遺傳變異。現(xiàn)將上述F2代群體的皂甙含量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，頻率分布見圖1，并用SPSS 13.0程序進行正態(tài)檢驗。結果表明，F(xiàn)2代單株皂甙含量為連續(xù)變異，且基本符合正態(tài)分布，其偏度為-0.544，峰度為0.52。

2.2 SSR遺傳圖譜的構建

根據(jù)對大豆公共遺傳連鎖圖譜的分析，選擇基本覆蓋大豆全基因組的500對SSR引物，用于在親本哈91016（♀）和N98-9445A（♂）間進行引物多態(tài)性篩選。對這500對SSR引物進行PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有112對引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物頻率為22.4%。將112對SSR引物逐一在F2群體中進行PCR擴增并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有106對多態(tài)性引物在198個F2群體中擴增出多態(tài)性良好、清晰的、穩(wěn)定的產(chǎn)物，多態(tài)性比率為21.2%。

用106個SSR標記鑒定群體染色體組成情況，其中來自哈91016（♀）的染色體片段占整個群體組成的24.36%，來自N98-9445A（♂）的染色體片段占群體染色體組成的23.28%，來自哈91016（♀）和N98-9445A（♂）的雜合片段占群體染色體組成的 44.36%，經(jīng)卡方檢驗（χ20.05,2=5.52；χ20.01,2=8.67），三者符合期望比率。表明該群體遺傳結構合理，適合遺傳圖譜構建和研究。

進一步對這些位點的基因組成進行χ2檢測，其中有61%的SSR標記在群體中符合理論分離比例，39%的標記呈現(xiàn)偏分離的趨勢，但這些標記對于構建遺傳連鎖圖譜和進行QTL掃描都是比較可靠的。分離群體中標記的偏分離現(xiàn)象普遍存在，與已有的報道相比，本研究中群體的偏分離標記比例較高。

圖1 F2代群體表型分布頻率Fig.1 Frequency of phenotype distribution of F2population

將篩選得到的106對多態(tài)性SSR標記用于連鎖分析，通過Mapmaker/EXP 3.0b構建連鎖圖譜，其中有87個SSR Marker被分配到1999年Cregan定義的20條染色體中的17條上。這87個SSR分子標記總長約為1 684.3 cM，分子標記間的平均距離為19.36 cM，標記在連鎖群上的分布是不均勻的，最多的是MLG K和MLG D1b連鎖群，各有10個標記，最少的是MLG A1和MLG E連鎖群，各有2個標記。MLG C2連鎖群最長，為139.6 cM，MLG J連鎖群最短，為14.9 cM。標記間大于10 cM的區(qū)段較普遍，可能與連鎖群不同部位發(fā)生交換的幾率不等，或雙親在這些連鎖群區(qū)段遺傳差異巨大有關，有待于進一步在間隙區(qū)尋找新的標記，以減小圖距，使遺傳圖譜更加飽和[8-10]。

2.3 與大豆皂甙含量相關的QTL分析

本研究利用復合區(qū)間法檢測與大豆皂甙含量有關的QTL，當LOD值大于2.0時，經(jīng)過WinQTL Cartographer v2.0計算共鑒定出2個與大豆皂甙含量相關的QTL（見圖2），Qts1位于K連鎖群上，標記區(qū)間為Sat_044～Satt102，與SSR標記Sat_044的遺傳距離是4.6 cM，LOD值2.09，遺傳貢獻率為12.6%，加性效應為正值（1.60），Qts2位于D1a連鎖群上，標記區(qū)間為Sat_036～Satt580，與SSR標記Satt580的遺傳距離是8.9 cM，LOD值2.87，遺傳貢獻率為15.8%；加性效應為正值（1.14），表明它的作用方向是增強皂甙含量的作用（見表1）。

圖2 與大豆皂甙含量相關的QTL定位圖譜Fig.2 Mapping QTLs associated with soyasaponin content

表1 與大豆皂甙含量相關的QTLsTable 1 QTLs associated with soyasaponin content

3 討論

選擇合適的雙親材料是創(chuàng)建理想作圖群體的關鍵之一。本研究所用的組合是高皂甙含量品種哈91016（13.6 mg·g-1）和低皂甙含量品種 N98-9445A（8.7 mg·g-1）進行雜交所衍生的 F2代群體。F2代皂甙含量高中低分布合理，群體單株的皂甙含量變異范圍較大。正態(tài)性驗證結果表明，該群體皂甙分布偏度為-0.54，所以F2代群體皂甙含量趨于正態(tài)分布，來自哈91016（♀）的基因片段占整個群體基因組成的24.36%，來自N98-9445A（♂）的基因片段占群體基因組成的23.28%，來自哈91016（♀）和N98-9445A（♂）的雜合基因片段占群體基因組成的44.36%，經(jīng)卡方檢驗（χ20.05,2=5.52；χ20.01,2=8.67），三者符合期望比率。表明該群體遺傳結構合理，是適合品質性狀作圖群體。目前，對于大豆皂甙的結構、性質、功效、機理等方面的研究報道較多，而對于大豆皂甙含量的分子標記方面的研究較少。尤其在國內(nèi)對于這方面的研究還處在初級階段。由于親本材料、定位群體的不同，難以對兩者作進一步的比較[11]。

4 結論

本試驗表明，大豆皂甙含量為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。本研究中得到2個與大豆皂甙含量相關的QTL，即：Qts1位于K連鎖群上，標記區(qū)間為Sat_044～Satt102，與SSR標記Sat_044的遺傳距離是4.6 cM，LOD值2.09，遺傳貢獻率為12.6%；Qts2位于D1a連鎖群上，標記區(qū)間為Sat_036～Satt580，與SSR標記Satt580的遺傳距離是 8.9 cM，LOD值2.87，遺傳貢獻率為15.8%。

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