蔡豐波,張長(zhǎng)山,魏 東

乳腺癌是世界女性最常見的惡性腫瘤之一,其早期發(fā)現(xiàn)確診對(duì)于病人的預(yù)后有決定性的影響,但目前尚無較理想的血清標(biāo)志物。常用的CA15-3 和CA27-29靈敏度和特異度均較差,而且對(duì)于早期腫瘤診斷效果更差,因此,尋找一種高靈敏度、高特異性的無創(chuàng)檢查技術(shù)一直為科研和臨床所關(guān)注。我們利用表面增強(qiáng)激光解吸附離子化時(shí)間飛行質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry, SELDI-TOFMS)技術(shù)研究了正常人和乳腺癌患者血清蛋白質(zhì)組構(gòu)型,發(fā)現(xiàn)血清中3種蛋白質(zhì)可作為一組特異性生物標(biāo)志物用于診斷乳腺癌,其靈敏度和特異性均在90%以上。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)3 種蛋白質(zhì)之一的M11368蛋白質(zhì)具有單獨(dú)應(yīng)用于臨床檢測(cè)的前景,其靈敏度和特異度均明顯優(yōu)于現(xiàn)在應(yīng)用的乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源標(biāo)本取自2007 ～2009年中國(guó)人民解放軍第150中心醫(yī)院乳腺癌術(shù)前患者共194例,年齡30 ～70歲,平均47.3 歲?；颊呔鶡o其他慢性疾病史,各年齡組分布如下:30 ～40歲12例, 40 ～50歲90例, 50 ～60歲80例, 60 ～70歲12例;正常對(duì)照組60人,平均49.0歲,其中30 ～40歲4人, 40 ～50歲32人, 50 ～60歲20人, 60 ～70歲4人。各乳腺癌病例均經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性癌,所有病例術(shù)前2 d采集空腹靜脈血3 ～5 m L,經(jīng)1 000 r/min離心取上清保存于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(sinapinic acid)、CHAPS、Tris-HCl等均購(gòu)自Sigma公司, ProteinChip(Biology System PBSⅡ)及其配套的IMAC30芯片、SELDITOFMS均購(gòu)于美國(guó)CipherGen公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1樣品的收集 采集全血3 ～5 m L于干燥管后立即放入4℃冰箱,靜置3 h后于4℃以1 000 r/min離心30 min,吸取血清分裝成每管100 μL,做好標(biāo)記,置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2樣品的準(zhǔn)備 融解冰凍血清并于4℃、1 000 r/min離心10 min,每個(gè)樣品取10 μL血清,分別置于1.5 mL離心管中,每管加20 μL U9 緩沖液(含9 mol/L尿素, 2% CHAPS, 50 mmol/L Tris-HCl,pH9.0), 4℃振蕩30 min,使蛋白變性,取10 μL變性后的樣品,每管加入120 μL U1緩沖液(U9緩沖液9倍稀釋而成)。

1.3.3IMAC30蛋白質(zhì)芯片的處理 將IMAC 30芯片安裝于Bioprocessor上,于各孔芯池中加入50 μL的100 mmol/L硫酸銅溶液, 4℃下200 r/min振蕩5 min,使銅離子與芯片活性表面螯合,待與蛋白質(zhì)上的磷酸化氨基酸相結(jié)合。甩去剩余的硫酸銅,用去離子水沖洗3次甩干。每孔芯池中加入100 mmol/L醋酸鈉(pH 4.0)50 μL, 4℃下 200 r/min振蕩 5 min,以洗脫未結(jié)合的銅離子。棄掉液體,各孔芯池加150 μL結(jié)合/洗脫緩沖液(50 mmol/L HEPES,pH 7.0)進(jìn)行平衡2次。將稀釋后的樣品取50 μL加入芯池中, 4℃孵育60 min后棄去多余液體,再用150 μL的HEPES緩沖液沖洗3次,洗脫未與芯池表面結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽段。取出芯片,自然風(fēng)干。將各孔芯池中加兩次SPA,每次為0.5 μL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用CipherGen ProteinChip軟件和BioMarkerW izard軟件對(duì)芯片檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)相對(duì)含量及蛋白質(zhì)質(zhì)荷比數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 用BioMarkerW izard軟件對(duì)不同組相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行方差分析。用數(shù)據(jù)挖掘軟件BioMarker Pattern對(duì)數(shù)據(jù)分組及相關(guān)性進(jìn)行分析[1-3]。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌術(shù)前組和正常人組血清蛋白質(zhì)分析(模型1) ①用Biomarker Wizard軟件對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,檢測(cè)到蛋白29個(gè)(圖1),其中兩組有13處蛋白質(zhì)存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 ②用BioMarkerW izard軟件和BioMarker Pattern軟件分析乳腺癌術(shù)前組和正常人組, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) M11368、M7768、M2943等3個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將2組準(zhǔn)確分組。應(yīng)用這3個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)生4個(gè)節(jié)點(diǎn)和5個(gè)終節(jié)點(diǎn),符合M11368≤0.607的176例樣本歸類到終節(jié)點(diǎn) 1, 均為乳腺癌術(shù)前組樣本;滿足 M11368≤1.187樣本歸類于節(jié)點(diǎn)3;M11368 >1.187的40例歸類于終節(jié)點(diǎn)5,均為正常人;節(jié)點(diǎn)3中滿足M7768 ≤12.377 樣本歸類于節(jié)點(diǎn) 4;節(jié)點(diǎn)3 中M7768>12.3771的18例歸類于終節(jié)點(diǎn)4,均為正常人;節(jié)點(diǎn)4中滿足M2943≤-1.496 的2例歸類于終節(jié)點(diǎn)2,為正常人, M2943>-1.496的18例歸類于終節(jié)點(diǎn)3,均為乳腺癌患者。錯(cuò)誤分組率4.72%,見表1。③顯著差異蛋白(P<0.05)中, M11368.51,M7927.657, M4210.317, M15866.88, M5339.615, M6008.986, M5907.982, M8139.478乳腺癌術(shù)前組含量低于正常人組, M3163.994, M4287.846, M2943.742,M3961.342含量高于正常人組。 ④以這3個(gè)蛋白質(zhì)所形成的分組模型, 184/194乳腺癌術(shù)前組和58/60正常人組被準(zhǔn)確分組,準(zhǔn)確率為95.28%(242/254)。⑤184/194乳腺癌術(shù)前組和58/60正常人組被準(zhǔn)確分組,靈敏度94.8%(184/194),特異度96.7%(58/60)。

2.2單獨(dú)應(yīng)用M11368蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)乳腺癌術(shù)前組和正常人組分析(模型2) ①使用該軟件單獨(dú)應(yīng)用M11368蛋白質(zhì)進(jìn)行分組, M11368≤0.607的178例樣本歸類到終節(jié)點(diǎn)1, 均為乳腺癌術(shù)前組樣本;M11368>0.607的76例樣本歸類到終節(jié)點(diǎn)2,靈敏度和特異度分別為89.69%(174/194)和93.33%(56/60),見表2;②174/194乳腺癌術(shù)前組和56/60正常人組被準(zhǔn)確分組,準(zhǔn)確率為90.55%(230/254)。

圖1 乳腺癌與正常人血清中蛋白質(zhì)峰

表1 模型1分組

表2 模型2分組

3 討論

乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的30%,死亡率占女性因惡性腫瘤死亡總?cè)藬?shù)的20%,僅次于肺癌。目前應(yīng)用于臨床檢測(cè), 經(jīng)FDA批準(zhǔn)的 CA15-3 和CA27-29因其較低的敏感性和特異性, 只能用于監(jiān)測(cè)治療效果和復(fù)發(fā)情況,不適于大批人群的早期乳腺癌的檢測(cè)血清標(biāo)志物。 CA15-3 診斷乳腺癌的敏感度為23%,特異度在69%左右, CA27-29靈敏度及特異度更低,僅50%的乳腺癌患者可在原位癌時(shí)被診斷。乳腺癌的常規(guī)檢查方法為乳房X線照相術(shù),其敏感度為75%～90%,特異度為75% ～90%,陽性預(yù)測(cè)值僅為25%[4]。同時(shí)由于亞洲婦女小而致密的乳腺腺體, 乳腺鉬靶攝片造成假陰性率較高[5]。我們所建3種蛋白質(zhì)組成的診斷模型1,預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到95.28%(242/254),其靈敏度和特異度分別為94.8%(184/194)和96.7%(58/60),遠(yuǎn)高于CA15-3和CA27-29。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)M11368蛋白質(zhì)具有在模型中的絕對(duì)主導(dǎo)地位, M11368≤0.607 的176例樣本歸類到終節(jié)點(diǎn) 1,均為乳腺癌術(shù)前組樣本;滿足M11368>1.187 的40 例樣本歸類于節(jié)點(diǎn)5,均為正常人;僅有38例標(biāo)本0.607

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