孟建博 張厚毅

1 山東省滕州市鮑溝中心衛(wèi)生院（277500）

2 山東省滕州市中心人民醫(yī)院（277500）

重度溶血的檢查自從有生化指標(biāo)檢測(cè)以來(lái)就存在干擾現(xiàn)象。在全自動(dòng)生化分析儀廣泛使用的今天，干擾依然存在。國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于消除干擾的文獻(xiàn)報(bào)道，但并未見(jiàn)推廣應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道[1,2]，溶血所致的血清中高濃度的Hb，對(duì)生化指標(biāo)檢測(cè)有干擾，消除干擾時(shí)使用高鐵氰化鉀法方法，雖能解決少部分問(wèn)題，卻未能系統(tǒng)地解決對(duì)其他項(xiàng)目的干擾。本研究將免疫學(xué)[3,4]方法引入到生化分析中。聚苯乙烯為載體的微球結(jié)合Hb抗體、在血清中與Hb發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成沉淀。離心分離上清液可將血清中干擾物質(zhì)比較徹底地從血清中分離，旨在為醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室消除生化檢測(cè)干擾探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 質(zhì)控血清

RANDOX 2。

1.1.2 人血清來(lái)源

36例健康體檢志愿者血清，無(wú)肉眼可見(jiàn)的脂血、溶血、黃疸。男17人，女19人，年齡18～62歲。

1.2 材料

1.2.1 血紅蛋白抗體（已經(jīng)聚苯乙烯微球結(jié)合）、生理鹽水（0.9%）、小玻璃試管、加樣器。

1.2.2 儀器

普通離心機(jī)、OLympus AU-2700生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集

所有體檢者均于清晨抽取空腹靜脈血4mL，分別向1個(gè)干燥小試管中注入2mL，1個(gè)肝素防凝管中2mL，37℃待檢及處理。

1.3.2 高Hb血清制備

防凝血棄去血漿，紅細(xì)胞用2倍體積的生理鹽水洗3次，放入－40℃冰箱內(nèi)（加等量生理鹽水）、融化后離心、棄去沉淀物，上機(jī)測(cè)Hb濃度，調(diào)整終濃度為16g/L按比例加入到500μL血清中，配制系列濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0g/L的膽紅素血清，補(bǔ)加適量生理鹽水，使血清的稀釋倍數(shù)為1倍。

1.3.3 高Hb血清的預(yù)處理

血清500μL加入高Hb溶液100μL，Hb抗體結(jié)合的免疫微球溶液適量，生理鹽水補(bǔ)加到總?cè)莘e1000μL，混勻，37℃水浴10min，離心分離，上清液待檢。

1.3.4 檢測(cè)

1.3.4.1 原始血清用在OLympus AU-2700上，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行38項(xiàng)生化項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.3.4.2 高Hb血清在OLympus AU-2700上，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行38項(xiàng)生化項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.3.4.3 經(jīng)預(yù)處理的高Hb血清上清液在OLympus AU-2700上，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行38項(xiàng)生化項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控血清的檢結(jié)果

見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)控血清的檢測(cè)結(jié)果

2.2 Hb對(duì)質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果的干擾

Hb濃度增高，TP、ALB、TB、DB、TB、PA、Cr、GLU、CK、CK-MB、LDH、HBDH、Ca、P、Mg、CHO、TG、apoA1、apoB、檢測(cè)結(jié)果也增高，UA、AMY、CO2CP、Lp（a）、IgM檢測(cè)結(jié)果降低。Hb＞0.5g/L時(shí)ALT、AST結(jié)果無(wú)法測(cè)出（表2）。

2.3 36例血清、人工Hb血清及Hb單抗除Hb后的檢測(cè)結(jié)果

表2 Hb對(duì)質(zhì)控血清檢測(cè)的干擾

人工Hb血清與對(duì)照血清比較TP、ALB、TBIL、DBIL、TBA、PA、Cr、UA、GLU、CK、CK-MB、LDH、HBDH、AMY、P、NCO2CP、apoB、Lp（a）、IgM顯著升高，P＜0.01，人工Hb血清與對(duì)照血清比較Ca升高，P＜0.05。除Hb血清與人工Hb血清比較，TP、ALB、TBIL、DBIL、TBA、PA、Cr、UA、GLU、CK、CKMB、LDH、HBDH、AMY、P、NCO2CP、apoB、Lp（a）、IgM顯著降低，P＜0.01，除Hb血清與人工Hb血清比較Ca降低，P＜0.05，而CK、CK-MB、LDH、P是另一種情況，即▲除Hb血清與人工Hb血清比較P＞0.05、與對(duì)照血清比較P＜0.01。#三組間任意兩組比較P＜0.01。人工Hb血清與對(duì)照血清比較P＜0.01，除Hb血清與人工Hb血清比較P＜0.05，除Hb血清與對(duì)照血清比較P＜0.01。

3 討 論

醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室日常工作中生化項(xiàng)目的檢測(cè)，對(duì)于患者的診治具有非常重要的作用。然而自從有關(guān)工作開(kāi)展以來(lái)，到今天全自動(dòng)分析儀廣泛應(yīng)用后，Hb對(duì)生化項(xiàng)目的干擾一直存在[5]，使用部分檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果偏離甚至嚴(yán)重偏離真實(shí)值，這種血液比例雖少（約5%），患者病情卻往往較重。本研究中也出現(xiàn)了日常工作中幾乎每天都遇到的情況，即檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果嚴(yán)重偏離真實(shí)值，甚至不顯示檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果。給臨床醫(yī)師診斷、治療患者帶來(lái)誤導(dǎo)作用不容忽視。

表3 36例血清、人工Hb血清及Hb抗體除Hb后的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 36例血清、人工Hb血清及Hb抗體除Hb后的檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：**人工Hb血清與對(duì)照血清比較P＜0.01，*人工Hb血清與對(duì)照血清比較P＜0.05?！鳌鞒鼿b血清與人工Hb血清比較P＜0.01，△除Hb血清與人工Hb血清比較P＜0.05?！鼿b血清與人工Hb血清比較P＞0.05、與對(duì)照血清比較P＜0.01。#三組間任意兩組比較P＜0.01?！钊斯b血清與對(duì)照血清比較P＜0.01，除Hb血清與人工Hb血清比較P＜0.05，除Hb血清與對(duì)照血清比較P＜0.01

序號(hào) 項(xiàng) 目 對(duì)照血清 人工Hb血清 除Hb血清 單 位1 ALT 21.5±7.4 21.8±7.3 U/L 2 AST 22.6±8.9 22.2±8.6 U/L 3** TP 69.2±5.2 78.3±7.6 68.1±5.5△△ g/L 4** ALB 41.3 ±4.9 50.4±6.7 41.8±4.6△△ g/L 5** TBIL 15.5±6.2 38.3±10.2 15.9±6.3△△ μmoL/L 6* DBIL 4.2±1.8 8.7±3.5 4.3±1.6△△ μmoL/L 7** TBA 5.5 ±2.2 12.7±3.8 5.6±2.4△△ μmoL/L 8** PA 286.2 ±63.5326.5±78.4 278.4±64.7△△ mg/L 9 BUN 5.2 ±2.5 5.4±2.4 5.3±2.6 mmoL/L 10** Cr 70.6±21.7 127.8±45.6 68.7±22.3△△ μmoL/L 11** UA 302.4 ±95.8216.3±67.8 308.1±97.4△△ μmoL/L 12** GLU 5.0±1.2 3.9±1.6 4.9±1.1△△ mmoL/L 13** CK 63.1 ±23.8413.5±112.4 409.6±107.5▲ U/L 14** CK-MB 18.5 ±6.2 97.8±21.7 9.1±2.4# U/L 15** LDH 156.3±42.5895.6±217.9 876.7±220.6▲ U/L 16** HBDH 112.9±25.2679.5±174.7 114.9±23.9△△ U/L 17 AMY 125.7±59.8 56.7±25.6 132.5±53.6△△ U/L 18 CHE 7.8±2.5 7.9±3.6 7.6±2.8 kU/L 19 ALP 97.1±52.5 99.6±54.1 95.8±49.5 U/L 20 GGT 35.3±19.6 37.4±17.8 36.2±20.5 U/L 21* Ca 2.52±0.11 2.9±0.17 2.45±0.13△ mmoL/L 22** P 1.1±0.42 2.5±0.58 2.2±0.46△☆ mmoL/L 23** Mg 0.76±0.23 1.22±0.37 0.82±0.24 mmoL/L 24** CO2CP 25.3±3.2 12.4±2.3 24.6±3.1△△ mmoL/L 25 CHO 5.3±1.6 6.6±1.8 5.4±1.8△△ mmoL/L 26 TG 1.1±0.4 1.7±0.6 1.2±0.3△△ mmoL/L 27 HDL 1.2±0.25 1.3±0.26 1.3±0.23 mmoL/L 28 apoA1 1.3±0.3 1.8±0.5 1.2±0.2△△ g/L 29** apoB 0.8±0.2 3.2±1.1 0.9±0.1△△ g/L 30** Lp(a) 205.4±90.7 167.5±64.7 196.6±92.7△△ mg/L 31 IgA 1.6±0.8 1.7±0.9 1.7±0.9 g/L 32 IgG 12.3±4.9 12.6±4.3 12.6±4.5 g/L 33** IgM 1.4±0.6 0.8±0.4 1.3±0.5△△ g/L 34 C3 1.0±0.37 1.2±0.34 1.1±0.36 g/L 35 C4 0.25±0.13 0.26±0.12 0.24±0.12 g/L 36 ASO 126.7±90.9123.7±92.4 124.2±88.9 IU/mL 37 RF 6.3±4.5 6.3±4.6 6.5±4.2 IU/mL 38 CRP 5.9±3.6 6.2±3.3 6.2±3.4 mg/L

實(shí)驗(yàn)室收到高Hb血清時(shí)，通常要求對(duì)患者重新取樣送檢，但有些患者做生化項(xiàng)目檢測(cè)是因病情需要，造成溶血的原因很多，重新取樣患者的家屬接受程度較難。輕度Hb對(duì)生化項(xiàng)目檢測(cè)的影響較小，試劑生產(chǎn)商通過(guò)改進(jìn)配方，調(diào)整實(shí)驗(yàn)參數(shù)，基本可消除上述影響。而重度高Hb通過(guò)上述方式處理卻不能消除干擾。我們做此研究的目的是將Hb從血清中分離出去絕大部分，血清中殘留的少部分不再對(duì)血清中其他成分造成干擾。

Hb的干擾機(jī)制及消除：文獻(xiàn)報(bào)道[2,6]，Hb濃度對(duì)Ca、Mg、CK、AST、LDH、HBDH、CK-MB均隨Hb濃度的增加而增高。溶血樣本Ca、Mg、TBII、DBIL偏高的原因主要是Hb本身的色澤所致，因這些項(xiàng)目均用化學(xué)試劑盒，反應(yīng)極其快速，自動(dòng)分析、手工分析時(shí)均無(wú)法設(shè)置樣本空血管和扣除本底空白，AST、LDH、HBDH升高是因RBC內(nèi)這些物質(zhì)含量高于血清，溶血后釋放人血漿以致使結(jié)果升高；雖然RBC內(nèi)無(wú)CK-MB，但溶血樣本中CK-MB明顯升高10倍，有人認(rèn)為[6]這可能是CK-MB試劑中的抗CK-MB抗體與Hb或分子中的珠蛋白發(fā)生了抗原抗體交叉反應(yīng)產(chǎn)生濁度，使單位時(shí)間內(nèi)吸光度假性升高，以致結(jié)果增高。apoA隨Hb濃度升高而降低，apoB則相反，可能原因Hb與apoB具有類抗原，apoA與Hb無(wú)類抗原。測(cè)定apoA時(shí)Hb阻礙apoA與其抗血清的反應(yīng)結(jié)果降低，測(cè)定apoB時(shí)Hb雖有阻礙作用，但Hb與抗apoB抗體發(fā)生的非特異性反應(yīng)大于其阻礙作用，最終使得結(jié)果升高，Cre、BUN、UA結(jié)果均隨Hb濃度升高，而降低是因Hb可抑制這些反應(yīng)。

溶血使紅細(xì)胞內(nèi)的Hb釋放到血清中，由于Hb在300～500nm有吸光度，對(duì)有些項(xiàng)目的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。國(guó)內(nèi)外報(bào)道，也有消除Hb的方法。這些方法雖然能起到一定的作用，但并未能將多余的Hb從血清中分離出去。我們利用Hb特異性抗體與血清中的Hb發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，結(jié)合抗體的免疫微球增加反應(yīng)的靈敏度，形成沉淀，可有效地離心分離掉絕大部分的Hb，消除了Hb的干擾。另外，溶血使RBC內(nèi)容物釋放到血清中，除Hb外，還有復(fù)雜的RBC內(nèi)容物，本研究只對(duì)Hb干擾作用進(jìn)行消除，至于TBC內(nèi)容物產(chǎn)生的干擾則過(guò)于復(fù)雜，如何消除未加以探討。

本研究中Hb抗體結(jié)合的微球，加入到血清中，隨后就發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，并形成沉淀，離心后已將絕大部分的Hb除去，檢測(cè)結(jié)果與正常對(duì)照比較無(wú)顯著性差別P＞0.05。有些項(xiàng)目如CK、LDH、AST、P等，溶血造成的干擾用Hb抗體結(jié)合的微球也不能消除，可能是復(fù)雜的RBC內(nèi)容物所致。目前，Hb抗體在檢驗(yàn)大、小便潛血方面得到廣泛應(yīng)用[3]，用于清除血清中高濃度Hb的方面的研究，至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究是利用了免疫反應(yīng)的特異性和免疫微球技術(shù)的高靈敏度來(lái)實(shí)現(xiàn)Hb從血清中分離，從而消除溶血對(duì)有些項(xiàng)目的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

[1] 叢玉隆,張海鵬.血液學(xué)檢驗(yàn)分析前質(zhì)量控制的重要因素[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1998,21(1):53.

[2] 劉露.血紅蛋白、膽紅素、脂血對(duì)全自動(dòng)生化分析儀干擾機(jī)制初探[J].山西臨床醫(yī)藥,2000,9(9):718.

[3] 蘭小鵬.免疫微球技術(shù)進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),1994,15(4):146.

[4] 岳秀玲.單克隆抗人血紅蛋白抗體法檢測(cè)尿中血紅蛋白[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志,1997,15(5):319.

[5] 劉丁.免疫學(xué)糞便隱血檢測(cè)的研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),1993,14(3):10.

[6] 靳敏.溶血對(duì)臨床生化檢驗(yàn)影響的探討[J].廣西醫(yī)學(xué),2002,24(9):1363.