王巧玲,羅蒲英,熊員煥

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2007級;2.江西省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,南昌330006)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg細(xì)胞)在維持自身免疫耐受中發(fā)揮著重要作用,它的缺失會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。但是這種細(xì)胞的調(diào)節(jié)因素現(xiàn)在還不是很清楚,大量研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以促進(jìn)T reg細(xì)胞的增殖[1]。最近Huber S.A.[2]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雌鼠在動情期感染柯薩奇病毒(CVB3)后其外周血中 Treg細(xì)胞比在其他時期感染時明顯增加,同時還發(fā)現(xiàn)給外源性17-β雌二醇予雌性小鼠可以保護(hù)它們感染CVB3后不罹患心肌炎,同時體內(nèi)的 Treg細(xì)胞也大量增加。這些研究說明小鼠動情周期中雌激素的變化可以影響T reg細(xì)胞。本研究旨在探討人體雌激素的變化對T reg細(xì)胞水平的影響,以闡明雌激素對機體免疫功能影響的分子機制,并為雌激素作為免疫調(diào)節(jié)治療自身免疫性疾病新方法的探索提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年10-12月江西省人民醫(yī)院體檢中心正常育齡女性20例,年齡 25～30歲,平均26.35歲。月經(jīng)周期28～30 d。

1.2 主要試劑與儀器

紅細(xì)胞裂解液、PBS緩沖液(美國BD公司),FITC anti-human CD4、PE anti-human CD25、同型陰性對照抗體(美國eBioscience公司),碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)。Beckman coulter XL流式細(xì)胞分析儀(美國Bekman Coulter公司),XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械廠),普通冰箱(中國海爾),LD4-2低轉(zhuǎn)速離心機(北京醫(yī)用離心機廠),GC-1200γ-放射免疫計數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司),電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械廠),KDC-2046低速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)。

1.3 方法

分別于月經(jīng)周期第 3、8、13、18、23天采集外周靜脈血。

1.3.1 標(biāo)本采集

于清晨 8:00～9:00空腹采取外周靜脈血5 mL,其中2 mL置于EDTA抗凝管中混勻,2 h內(nèi)檢測Treg細(xì)胞水平;3 mL置于普通管中,4 h內(nèi)檢測雌激素。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)分析Treg細(xì)胞

用 10 μ L 移 液器分別取 FITC-抗 CD4 、PE-抗CD25 20 μ L 加入清潔試管 ;用 100 μ L 移液器向上管加入100 μ L抗凝全血,并充分混勻,同時設(shè)同型陰性對照管;室溫避光孵育20 min;加入300 μ L紅細(xì)胞裂解液,并用微型混合器震蕩5 s;室溫避光孵育15 min,待紅細(xì)胞充分裂解;低轉(zhuǎn)速離心機以1 400 r?min-1離心 5 min,棄上清液;PBS緩沖液1 mL洗滌1次;加入緩沖液400 μ L重新懸浮細(xì)胞;上流式細(xì)胞儀檢測,Flowjo v 7.6流式分析軟件分析Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞的百分比。

1.3.3 放射免疫法(RIA)測定外周血清雌激素水平

低轉(zhuǎn)速離心機以1 400 r?min-1離心5 min,分離血清;NSB管中加入“0”濃度標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記物及蒸餾水各 200 μ L;各濃度(0 、10 、50、100、250 、750、2 000 ng?L-1)標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記物、抗體各 200 μ L;標(biāo)本管中加入血清、標(biāo)記物、抗體各200 μ L;充分混勻后置于37℃水溫箱1.5 h;各管中加入分離劑1 000 μ L;充分混勻,4 ℃3 600 r?min-1離心20 min,棄上清液;各管按次序放置于Υ-放射免疫計數(shù)器測量架上,設(shè)定參數(shù),配套電腦自動分析雌激素水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

1) 20例正常女性外周血中雌激素水平呈現(xiàn)周期性變化,于月經(jīng)周期第13天水平最高,顯著高于第 3、8、18、23天水平(P＜0.05);第 3天水平最低,顯著低于第8、13、18、23天水平(P ＜0.05)。而外周血Treg細(xì)胞也隨雌激素水平變化呈現(xiàn)周期性波動,于月經(jīng)周期第13天水平最高,顯著高于第3、8、18、23天水平(P ＜0.05);第3天水平最低,顯著低于第8、13、18、23天水平(P ＜0.05)。外周血雌激素和T reg細(xì)胞水平月經(jīng)周期第8天與第18天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 月經(jīng)周期中Treg細(xì)胞水平及雌激素水平變化的比較

表1 月經(jīng)周期中Treg細(xì)胞水平及雌激素水平變化的比較

檢測指標(biāo) 第3天 第8天 第13天 第18天 第23天Treg細(xì)胞/% 11.27±1.23 13.52±1.64 20.72±2.24 14.38±1.45 17.33±1.40雌激素水平/(ng? L-1) 37.90±8.94 93.09±11.86 204.27±24.01 105.47±14.45 171.68±19.21

2) 取月經(jīng)周期第13天外周血雌激素水平及T reg細(xì)胞水平進(jìn)行pearson相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn) Treg細(xì)胞與雌激素水平呈正相關(guān)(r=0.615,P＜0.005)。

3 討論

在我國,自身免疫性疾病發(fā)病率高、病程長,且預(yù)后不佳。其中結(jié)締組織病和神經(jīng)肌肉疾病還有較高的致殘率。近年來,自身免疫性疾病發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,而在治療上以應(yīng)用激素和免疫抑制劑短期緩解癥狀為主,效果不佳且不良反應(yīng)明顯。因而尋找新的有效的治療方法倍受重視。

1995年Sakaguchi S.等[3]發(fā)現(xiàn)將 CD4+T細(xì)胞中的CD25+細(xì)胞剔除后即CD4+CD25-T細(xì)胞接種到裸鼠中結(jié)果導(dǎo)致裸鼠都發(fā)生了自身免疫性疾病,包括甲狀腺炎、胃炎、多關(guān)節(jié)炎等,而在接種后一定時間內(nèi)注入Treg細(xì)胞可以抑制這些自身免疫性疾病的發(fā)生,表明 Treg細(xì)胞可抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。此后的研究表明Treg細(xì)胞在外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用[4],并在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)雌激素與T reg細(xì)胞的關(guān)系密切,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)生理劑量的雌二醇(E2)可以促使小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞向T reg細(xì)胞轉(zhuǎn)化,使不同組織中的Treg細(xì)胞增加[5]。

本研究也證實了在女性月經(jīng)周期中T reg細(xì)胞隨著體內(nèi)雌激素的變化而出現(xiàn)波動,據(jù)此推測在女性體內(nèi)是否因為T reg細(xì)胞的波動引起免疫內(nèi)環(huán)境的不穩(wěn)定狀態(tài),最終引起自身免疫耐受功能異常,導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。這也可以解釋一些臨床現(xiàn)象,如:多發(fā)性硬化癥(MS)女性發(fā)病明顯高于男性,女性從月經(jīng)初潮起,MS的發(fā)病率逐漸增加,到絕經(jīng)期達(dá)到高峰。筆者認(rèn)為雌激素可以通過調(diào)節(jié)T reg細(xì)胞而在自身免疫性疾病的發(fā)生中起了一定的作用。

在動物實驗中,發(fā)現(xiàn)在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型誘導(dǎo)期口服乙烯雌酚可以抑制EAE的發(fā)展[6]。后來的研究發(fā)現(xiàn)在MS的動物模型EAE誘導(dǎo)期給予低劑量的E2(劑量在妊娠水平與動情期水平之間)皮下注射,可以顯著抑制不同種系小鼠疾病的發(fā)展[7]。Huber S.A.[2]給外源性17-雌二醇予雌性小鼠可以保護(hù)它們感染CVB3后不罹患心肌炎,而且體內(nèi)的T reg細(xì)胞也升高,這給筆者一些提示,是否可以將雌激素作為治療自身免疫性疾病的一個新的突破口?筆者將繼續(xù)進(jìn)行系列研究,為雌激素作為免疫調(diào)節(jié)治療的新方法提供依據(jù)。

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[3] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 recepto r alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease[J].J Immunol 1995,155(3):1151-1164.

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