趙益峰,王海濱,孟純陽,賈存嶺,張?jiān)?孔祥清,高峰

(山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科,山東 濟(jì)寧 272000)

長期以來,在動物實(shí)驗(yàn)中對骨折愈合的評價(jià)往往主要依靠 X線片和骨痂標(biāo)本的組織學(xué)及組織化學(xué)觀察[1]。然而,對骨痂愈合的組織學(xué)評分方法本身具有很大的主觀性,且得到的是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的計(jì)數(shù)資料,帶有一定的局限性,因此需要尋找能定量反映骨折愈合的較為理想、客觀的計(jì)量指標(biāo)[2]。有作者實(shí)驗(yàn)表明[3],骨痂灰度,骨礦物質(zhì)含量以及骨的生物力學(xué)參數(shù)之間有著明顯的相關(guān)關(guān)系,可以對骨折愈合進(jìn)行綜合評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)對節(jié)段性骨缺損修復(fù)過程中骨礦的幾種代表微量元素鈣(Ca)、鋅 (Zn)、鎂(Mg)、銅(Cu)的含量變化作了初步研究,對它們是否可以作為骨折愈合的評價(jià)指標(biāo)提出了初步見解。

1 材料和方法

1.1 兔骨缺損修復(fù)材料的制作 7只新西蘭大白兔(雄性,2～ 2.5 kg,濟(jì)南農(nóng)科院畜牧所種兔廠),取長 1.5 cm尺橈骨共 84枚 ,12枚經(jīng)-80℃深低溫冰箱冷凍、脫水、脫脂、干燥,60CO照射等制成深低溫冷凍骨;另 12枚經(jīng)同樣上述程序處理后再在 0.6N鹽酸中脫鈣等制成深低溫冷凍脫鈣骨基質(zhì);另 60枚制成脫鈣骨基質(zhì)。

1.2 骨缺損支架材料的構(gòu)建 A1:指上述所制保持完整管狀的脫鈣骨基質(zhì);A2:指 A1一劈為二,1/2旋轉(zhuǎn) 180°與另一半組合;B1:指 A1復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子 1000IU(將含 1000 IU堿性成纖維細(xì)胞生長因子的水溶液 0.1 mL滴入材料髓腔 2 h);B2:指 A2復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子1000 IU;C1:指髓腔中注滿宿主兔的自體骨髓的 A1;C2:空白對照組,指實(shí)驗(yàn)兔骨缺損處不植入任何材料;D1:指上述所制的保持完整管狀的深低溫冷凍脫鈣骨基質(zhì);D2:指上述所制的保持完整管狀的深低溫冷凍骨。

1.3 骨缺損動物模型制作、修復(fù)材料植入及動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)新西蘭大白兔 40只,按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法分配成四組A、B、C、D,每組 10只,在兔雙側(cè)橈骨中上段做 1.5 cm長的節(jié)段性骨膜骨缺損模型,A組隨機(jī)一側(cè)前肢植入上述材料A1,另一側(cè)植入 A2;以此類推,B、C、D組的一側(cè)前肢隨機(jī)分別植入材料 B1、 C1、D1,另一側(cè)分別植入材料 B2、 C2、 D2。

1.4 實(shí)驗(yàn)檢測 于手術(shù)后第 1、2、4、8、12周各組分別隨機(jī)殺死 2只實(shí)驗(yàn)兔做如下檢測。

1.4.1 X線檢查 實(shí)驗(yàn)兔空氣栓塞處死后立即進(jìn)行雙前肢同樣條件下 X線片檢查。

1.4.2 組織學(xué)檢測 缺損移植區(qū)取材后剔除表面軟組織,材料一半多聚甲醛固定,甲酸脫鈣,叔丁醇透明,常規(guī)石蠟包埋、制片,HE染色,普通顯微鏡觀察。

1.4.3 金屬元素含量的測定 取材的另 1/2稱重,勻漿,離心,沉淀物用火焰原子吸收分光光度儀行 Ca、Zn、Mg、Cu等金屬元素的測定。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 金屬元素測定結(jié)果應(yīng)用 SPSS10.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析 (采用 Tukey HSD法或 LSD法),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)期間各組動物均順利完成預(yù)期實(shí)驗(yàn)。

2.1 X線檢查 術(shù)后 12周除 C2空白對照組骨缺損未愈合外,其余各組均達(dá)到完全骨性愈合,各組缺損修復(fù)區(qū)已基本上接近正常橈骨,髓腔已基本上完全再通,尺橈骨間基本上已相互獨(dú)立。

2.2 組織學(xué)檢測 術(shù)后 12周除 C2空白對照組骨缺損未愈合外,其余各組均達(dá)到骨性愈合。板層骨均已轉(zhuǎn)化成稍欠成熟的皮質(zhì)骨,髓腔已全部再通,骨髓都已轉(zhuǎn)化成成熟骨髓。

2.3 金屬元素含量的測定 鈣含量的測定結(jié)果見表 1。各時間點(diǎn)之間 Ca含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者(P＜0.05,Tukey HSD法 )見于 a、 b間 ,a、 d間 ,b、 c間 ,c、d間 ,見圖 1。

鋅含量的測定結(jié)果見表 2。各時間點(diǎn)間 Zn含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者 (P ＜0.05,LSD法)見于 a、b間,a、c間 ,a、d間 ,a、e間 ,b、e間 ,c、 d間 ,c、 e間 ,見圖 2。

鎂含量的測定結(jié)果見表 3。各時間點(diǎn)間 Mg值含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者(P ＜0.05,LSD法)見于 a、b間,a、d間,b、c間 ,d、 c間 ,見圖 3。

銅含量的測定結(jié)果見表 4。各時間點(diǎn)間 Cu值含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者(P ＜0.05,LSD法)見于 a、e間,b、e間,c、 e間 ,見圖 4。

表1 各時間點(diǎn)各組標(biāo)本單位濕重 Ca值(μ g/mg)

表2 各時間點(diǎn)各組標(biāo)本單位濕重 Zn值(μ g/mg)

表3 各時間點(diǎn)各組標(biāo)本單位濕重 Mg值(μg/mg)

表4 各時間點(diǎn)各組標(biāo)本單位濕重 Cu值 (μg/mg)

圖1 各時間點(diǎn) Ca值變化

3 討 論

圖2 各時間點(diǎn) Zn值變化

圖3 各時間點(diǎn) Mg值變化

圖4 各時間點(diǎn) Cu值變化

同種異體脫鈣骨基質(zhì)、同種異體深低溫冷凍骨以及自體骨髓均能修復(fù)骨缺損,國內(nèi)外作者已經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),用一定的材料將骨缺損部位與周圍組織間隔,能夠促進(jìn)骨缺損的修復(fù),此即引導(dǎo)性骨再生理論,也有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)?；谝陨蟽煞N骨缺損修復(fù)理論,本實(shí)驗(yàn)將同種異體的管型脫鈣骨基質(zhì)、管型深低溫冷凍骨作保留管型及劈裂不保留管型等構(gòu)建(見上述材料和方法中兔骨缺損修復(fù)材料的制作以及骨缺損支架材料的構(gòu)建),觀察到術(shù)后 12周時除 C2空白對照組骨缺損未修復(fù)外,其余各組無論從 X線片表現(xiàn)、取材術(shù)中所見以及組織學(xué)表現(xiàn)均顯示骨缺損已經(jīng)較好的修復(fù),當(dāng)然在術(shù)后不同時間點(diǎn)各不同修復(fù)材料的修復(fù)進(jìn)度仍表現(xiàn)出較大的差別。各種不同條件下骨缺損修復(fù)過程中,微量元素 Ca、Zn、Mg、Cu的變化規(guī)律及其與骨缺損修復(fù)進(jìn)程的相關(guān)性探討如下。

鈣是骨的主要金屬元素之一,骨缺損修復(fù)后骨痂的多少,換言之鈣含量的多少可以直接說明骨修復(fù)的程度。我們對實(shí)驗(yàn)中不同支架材料在不同時間點(diǎn)所修復(fù)的缺損標(biāo)本全部予以鈣含量測定 ,結(jié)果見表 1。從圖 1可以看出,術(shù)后 2、8、12周各材料的鈣含量均較術(shù)后第 1周有明顯的提高,但術(shù)后第 4周鈣含量明顯較第 2周降低,之后又明顯提高,這和有關(guān)作者[4]骨痂鈣在整個骨折愈合期均穩(wěn)定的報(bào)道不符。分析原因,可能術(shù)后第 4周末各材料正達(dá)編織骨期向板層骨期轉(zhuǎn)化的高峰,此時需要髓腔的整合與貫通,鈣大量分解吸收,造成此期鈣含量下降;之后前期板層骨及板層骨鈣開始大量沉積,致使鈣含量自 4周末開始上升,8周末達(dá)高峰,8周末后進(jìn)入塑形期,少量不在力線上的骨質(zhì)被吸收,導(dǎo)致 8周末后鈣含量輕度下降,但總的趨勢是材料移植后鈣含量逐漸增加。基于上述原因,鈣作為評價(jià)成骨活性大小的指標(biāo),取材應(yīng)有時間限制,應(yīng)避開編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化的高峰期。

在骨形成和代謝過程中,三種代謝酶類即堿性磷酸酶、膠原酶和碳酸酐酶起著重要作用,鋅是三種酶的重要輔助因子。 Haumont在 1961年就報(bào)告鋅主要集中在鈣化前的類骨質(zhì)中,這與骨中堿性磷酸酶最大含量一致。缺鋅時,主要是堿性磷酸酶的含量受到影響。 Zorrilla等[5]發(fā)現(xiàn)血清鋅過低的髖部骨折患者愈合受到影響,血鋅值可以作為髖部骨折患者能否愈合的預(yù)測指標(biāo)。國內(nèi)學(xué)者藍(lán)文正等[4]對 72只家兔橈骨進(jìn)行試驗(yàn)性骨折,發(fā)現(xiàn)鋅在骨折處的代謝高于對側(cè)相應(yīng)部位的水平,且骨鋅在第 4周出現(xiàn)高峰值,表明骨愈合過程中局部鋅代謝是旺盛的。鋅對破骨細(xì)胞的形成具有潛在的抑制作用,并與其他抗骨吸收因子如降鈣素、雌二醇相同,抑制作用發(fā)生于骨髓細(xì)胞分化的晚期。鋅可能是破骨細(xì)胞膜質(zhì)子泵的抑制劑,對骨吸收具有直接的抑制作用。我們對骨缺損修復(fù)區(qū)內(nèi)骨組織的鋅含量進(jìn)行測量,從中試圖得到有益的信息(見表 2)。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來看,骨鋅在第 2周末就達(dá)到第一個高峰值(P＜0.05),一直維持同一水平持續(xù)到第 4周末。之后骨鋅值繼續(xù)升高,到第 8周末到達(dá)第二個峰值(P＜0.05),之后基本上維持在此水平 (見圖 2),這和有關(guān)作者[4]的觀察同樣有出入。另外,統(tǒng)計(jì)分析還可以看出 ,對不同材料間的骨鋅值進(jìn)行比較得出一個有趣的現(xiàn)象:越是成骨活性較好的材料其骨鋅均數(shù)值越低,越是成骨活性較差的材料其骨鋅均數(shù)值越高,這和已知的骨鋅值的作用似乎正好相反,其中的原理有待進(jìn)一步明確。并且骨鋅值是否可以作為一個評價(jià)材料成骨活性的指標(biāo)(骨鋅值高則材料成骨活性低、骨鋅值低則成骨活性高)還有待于我們進(jìn)一步探究。

Mg是機(jī)體一種必需元素 ,是多種酶的激活因子,可激活多種水解酶、合成酶、激酶和羥化酶,參與三磷酸腺苷的依賴性反應(yīng),影響蛋白質(zhì)、核酸合成。 Ryder等[6]發(fā)現(xiàn)白種人較多攝入鎂后其骨礦量明顯增高。翟照等[7]通過對家兔行骨折部位自體骨髓移植,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂量明顯多于對照側(cè),同時骨痂中鎂含量亦高于對照側(cè)。我們對各種不同支架材料修復(fù)骨缺損后不同時間點(diǎn)骨痂中的鎂含量作了測定(見表 3),結(jié)合 X線、組織學(xué)檢測,以期發(fā)現(xiàn)兩者間是否具有某種程度的相關(guān)性。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出,骨缺損區(qū)材料移植后第 2周末骨鎂值達(dá)高峰(P＜0.05),之后未像骨鋅值那樣維持同一水平至第 4周,而是到第 4周末下降至第一周時的水平(P＜0.05),之后又繼續(xù)升高,至第8周末升至第二個峰值(P＜0.05),之后基本上維持這一峰值但也有所下降(P＞0.05)(見圖 3),這種變化和 Ca的變化趨勢極其相似(見圖 1)。另外我們還發(fā)現(xiàn),不同的移植材料其骨鎂值出現(xiàn)的變化與骨鋅值相似,即越是成骨活性較好的材料其骨鎂值越低,越是成骨活性較差的材料其骨鎂值越高,這和有關(guān)作者[7]做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,其原理有待于闡明,且骨鎂值可作為成骨活性檢測指標(biāo)也有待于明確。基于與鈣相同的原因,其取材時間也應(yīng)受類似的限制。

Cu是體內(nèi)必需的微量元素,是骨和酶系統(tǒng)的重要組成部分,是骨愈合中最活躍的因素[4],是某些酶的激活物質(zhì),銅借助這類酶對成骨細(xì)胞起激活作用。翟照等[7]在家兔自體骨髓移植骨痂銅含量檢測中發(fā)現(xiàn),骨髓移植后 2周實(shí)驗(yàn)側(cè)高于對照側(cè),推測可能為銅促進(jìn)膠原纖維交聯(lián),同時發(fā)現(xiàn)這種作用僅限于骨髓移植術(shù)后的 2周內(nèi) ,術(shù)后 6周時骨痂中銅達(dá)峰值,兩側(cè)無顯著性差異。我們在本實(shí)驗(yàn)中對各時間點(diǎn)各組的缺損區(qū)標(biāo)本均作了銅含量測定(見表 4),并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果和上述實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果不相同。統(tǒng)計(jì)顯示,各組材料移植術(shù)后第 1、2、4周骨銅水平很穩(wěn)定,直到第 4周末才有輕度上升 (P＞0.05),第 8周末后骨銅水平明顯上升,至 12周末達(dá)峰值(P＜0.05)(見圖 4)。12周后是否還上升,因我們的實(shí)驗(yàn)最后一批取材在第 12周末 ,結(jié)果還不清楚。從本資料來看,銅并非骨缺損修復(fù)過程中的活躍元素,它不適于作為成骨活性的檢測指標(biāo)。

[1]Nunamaker DM.Experimental models of fracture repair[J].Clin Orthop Relat Res,1998,(355 Suppl):56-61.

[2]Markel MD,Chao EY.Noninvasive monitoring techniques for quantitative description of callus mineral content and mechanical properties[J].Clin Orthop Relat Res,1993,(293):37-40.

[3]鮑善芬,趙霖,劉玉杰,等.金屬銅對骨折愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中華外科雜志,2002,40(7):538-543.

[4]藍(lán)文正,劉國棟,沙因,等.骨折愈合過程中微量元素含量的研究 [J].中華骨科雜志,1989,9(4):200-203.

[5]Zorrilla P,Salido JA,L′opez-Alonso A,et al.Serum zinc as a prognostic tool for wound healing in hip hemiarthroplasty[J].Clin Orthop Relat Res,2004,(420):304-308.

[6]Ryder KM,Shorr RI,Bush AJ,et al.Magnesium intake from food and supplements is associated with bone mineral density in healthy older white subjects[J].J Am Geriatri Soci,2005,53(11):1875-1880.

[7]翟照,陳鳳苞.家兔自體骨髓移植對骨痂中鈣鎂銅含量的影響 [J].中國骨傷 ,2002,15(2):82.