曾 攀,黃嵐珍,范才文,易世江,肖勝軍,,Huanbiao Mo,向 秋,*

(1桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,桂林 541004;2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3 Texas Woman′s University)

三烯生育酚是維生素 E的組成成分,目前發(fā)現(xiàn)有 α、β、γ和 δ三烯生育酚等四種成分。研究提示,三烯生育酚在保護(hù)神經(jīng)、抗癌、降低膽固醇以及抗氧化等方面具有生物學(xué)活性[1]。α-三烯生育酚、γ-三烯生育酚和 δ-三烯生育酚有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[2]。鼻咽癌是一種高侵襲轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤,早期診斷困難,目前對(duì)其主要采用放療,但效果不理想,5 a生存率較低。近半年來(lái),我們觀察了 d-δ-三烯生育酚對(duì)低分化 5-8F鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響,探討 d-δ-三烯生育酚抗鼻咽癌的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料 低分化 5-8F鼻咽癌細(xì)胞系(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院);d-δ-三烯生育酚(美國(guó)德克薩斯女子大學(xué)食品與營(yíng)養(yǎng)研究所);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶、MTT、DMSO(sigma公司);RPMI1604(Gibco公司);Hoechst33258(碧云天生物技術(shù)研究所);RPIM-1640培養(yǎng)基(含 10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于含 RPIM-1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞分為對(duì)照組和觀察組,實(shí)驗(yàn)組設(shè) 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚三個(gè)濃度。

1.2.2 d-δ-三烯生育酚干預(yù)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)將 5-8F細(xì)胞接種于 6孔板中,密度為 5×104/孔,每孔 2.0 ml。培養(yǎng) 24 h后更換培養(yǎng)基,觀察組加入 dδ-三烯生育酚(濃度分別為 40、50、60 μmol/L)。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,吸去培養(yǎng)基,每孔加入 4%多聚甲醛0.5～1.0 ml,室溫下固定 10 min。去固定液,用PBS洗 2次,每孔加入適量 Hoechst33258染料,染色10 min。PBS洗 2次后,加一滴抗熒光淬滅封片液封片,置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況 。

1.2.3 d-δ-三烯生育酚干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整密度為 2.5×104/ml,接種于 96孔板,每孔 0.2 ml。培養(yǎng) 24 h后換培養(yǎng)基,分別加入 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚,每個(gè)濃度設(shè)置 4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后,每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。去上清,每孔加入 200μl DMSO,振蕩器上輕輕振蕩 5～10 min使結(jié)晶完全溶解,置 490 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均 OD值 /對(duì)照組平均 OD值)×100%。

1.2.4 d-δ-三烯生育酚干預(yù)及細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 5-8F細(xì)胞接種于 100 ml的玻璃培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿至 60%～70%后,換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h使細(xì)胞周期同步化。分別加入 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚 ,每個(gè)濃度同時(shí)加入 10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后,收集細(xì)胞,以 70%預(yù)冷的乙醇 4℃固定過(guò)夜。離心洗滌后,調(diào)整細(xì)胞濃度至(1×105～1×106)/ml,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,計(jì)算 S期細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。多組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)的單因素(One-Way ANOVA)方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 d-δ-三烯生育酚干預(yù)后細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)變化d-δ-三烯生育酚干預(yù) 48 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制,形態(tài)發(fā)生明顯改變:對(duì)照組貼壁細(xì)胞增多,輪廓清楚,細(xì)胞間接觸緊密;觀察組隨濃度增加,貼壁細(xì)胞逐漸減少,變圓、漂浮的死亡細(xì)胞增多。Hochest染色顯示,核熒光強(qiáng)染色、核固縮細(xì)胞比例隨d-δ-三烯生育酚的濃度增加而升高,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀或條塊狀熒光。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及 S期細(xì)胞百分率比較 見(jiàn)表 1。

表 1 兩組細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡率及 S期細(xì)胞百分率比較(%,ˉx±s)

3 討論

生育酚和三烯生育酚的主要區(qū)別在于前者的側(cè)鏈為飽和脂肪酸,后者的側(cè)鏈則是含有三個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸。盡管兩者在結(jié)構(gòu)上有很大的相似性,但其生物學(xué)功能差異顯著。在抗腫瘤方面,三烯生育酚比生育酚具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性[3]。據(jù)報(bào)道,口服 δ-三烯生育酚能有效抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]。Wada等[5]研究四種三烯生育酚亞型對(duì)人肝癌細(xì)胞 HepG2的抑制作用,結(jié)果表明,δ-生育三烯酚與 α-、β-和 γ-三烯生育酚相比,抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的能力更強(qiáng)。Srivastava等[6]研究富含三烯生育酚的棕櫚油對(duì)正常人前列腺細(xì)胞和人前列腺癌細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)三烯生育酚可選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞活性,而對(duì)正常細(xì)胞的影響較小。本研究結(jié)果顯示,δ-三烯生育酚對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用,可將細(xì)胞阻滯于 S期,且呈劑量依賴性,60μmol/L的 δ-三烯生育酚對(duì)鼻咽癌 5-8F細(xì)胞的抑制率達(dá) 95%以上。

三烯生育酚誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制:①促進(jìn)雌激素 β受體向核定位轉(zhuǎn)移,激活雌激素作用因子,誘導(dǎo) DNA斷裂和 Caspase-3活化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7,8]。②使凋亡因子 Caspase-8、Caspase-9和 Bax等表達(dá)升高[9]。本研究結(jié)果表明,δ-三烯生育酚有促進(jìn)鼻咽癌凋亡的作用。

目前,δ-三烯生育酚抗鼻咽癌的報(bào)道不多,本研究結(jié)果證實(shí),其是一種潛在的抗鼻咽癌的天然產(chǎn)物,其生物學(xué)活性和分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。

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