王 偉,肖穎彬,程 偉

(第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍心血管外科中心,重慶400037)

心房纖顫(房顫)是臨床常見的心律失常,是很多心血管疾病出現(xiàn)的一種表現(xiàn),其發(fā)病率較高。目前對于房顫的病理生理機制尚不完全清楚,導(dǎo)致對于房顫的治療效果欠佳。在房顫的相關(guān)研究中,動物模型或臨床病例標本具有諸多局限性[1],所以建立房顫的細胞模型有重要的意義。本研究旨在探索原代心房肌細胞體外培養(yǎng)方法和快速電場起搏模型的建立,并對快速電場起搏后心房肌的電生理特性進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇1周左右的Wistar乳鼠,雌雄不拘,由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器 BL-420生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),CO2孵箱,倒置顯微鏡;微電極拉制儀;玻璃微電極:內(nèi)徑1.6 mm,有芯,長10 cm;阻抗 3～5 MΩ;膜片鉗放大器;心肌細胞灌流及封接監(jiān)視系統(tǒng):自制單細胞灌流槽,電視監(jiān)視系統(tǒng)觀察細胞及指導(dǎo)封接過程;微電極操縱器;分析軟件(德國HEKA公司)。

1.3 主要試劑 DM EM 培養(yǎng)基、胎牛血清、D-hank′s液(Hyclone公司);Ⅱ型膠原酶及5-溴脫氧尿核苷(Brdu,Sigma公司);小鼠抗大鼠Sarcomerie actin單抗(博士德公司);FITC標記山羊抗小鼠IgG(中山金橋公司);用于記錄動作電位的正常細胞外液組成為(mM):137 NaCl,5.4 KCl,1 MgCl2,10 glucose,10 HEPES,以NaOH調(diào)pH至7.40;電極內(nèi)液的組成為(mM):150 KCl,1 M gCl2,5 HEPES,10 EGTA,5 Na2ATP,以KOH調(diào)pH至7.20。

1.4 心房肌細胞分離和培養(yǎng) 參考Benardeau等[2]的原代心房肌細胞培養(yǎng)方法并加以改良。消毒后開胸,迅速切除心臟并置于D-hank′s液中清洗、去血,取左、右心房,在手術(shù)用放大鏡下仔細去除血管、心房及結(jié)締組織,用無血清培養(yǎng)基洗滌,無菌條件下用眼科剪將右心耳修剪成直徑約1 mm大小的組織塊。在組織塊中加入0.08%胰酶,37℃水浴5 min,輕柔吹打,留取上清液加入冷的含15%小牛血清的DMEM中中止消化,反復(fù)消化3次。之后向剩余組織中加入0.08%Ⅱ型膠原酶,35～36℃水浴中消化20 min,吹打收集上清液于冷的含15%小牛血清的DMEM中。再重復(fù)此步驟2～3次。將每次收集的細胞懸液移入離心管中,4℃1 000 r/min離心5 min,棄上清液,再用 DM EM培養(yǎng)液洗細胞 1次,離心,棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),打散細胞團為單細胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中,置培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)45 min后,上清液再培養(yǎng)45 min,用2次差速貼壁法去除成纖維細胞。貼壁后的上清液用臺盼藍染色法計數(shù)活細胞數(shù),將其調(diào)成細胞濃度為5×105個/mL之后,加入Brdu使其終濃度為0.1 mM,并繼續(xù)培養(yǎng)接種于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),置 CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)。24 h后換液,加不含 Brdu的DMEM培養(yǎng)液,并用倒置顯微鏡觀察。

1.5 快速刺激心房肌細胞模型建立 采用銅電極片,厚度0.3 mm,長15 cm,寬10 cm,電極間距為10.0 cm,兩電極平行放置,用絕緣體固定,防止兩電極間導(dǎo)電。倒置顯微鏡觀察細胞貼壁80%左右時,在37℃、5%CO2孵箱中將培養(yǎng)板置于電場中用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)給予刺激,刺激頻率10 Hz,強度 1.5 V/cm,分別進行電場刺激 6、12、24、48 h。

1.6 心房肌細胞純度的鑒定 用4%多聚甲醛固定20 min,分別做熒光免疫組化。取待用細胞片,0.01 mol/L PBS液洗3次,每次5 min,吹干。以0.1%BSA封閉非特異性反應(yīng)(37℃水浴30 min),3%H2O2封閉(37℃水浴30 min),細胞片加小鼠抗大鼠Sarcomerie actin(4℃過夜),PBS液洗5 min×3次,加大鼠抗小鼠IgG-FITC(37℃,1 h),熒光顯微鏡下觀察并攝片。陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 全細胞膜片鉗記錄 在全細胞膜片鉗記錄中,采用電壓鉗模式(voltage-clamp mode)記錄離子通道電流;采用電流鉗模式(current-clamp mode)記錄動作電位。取細胞爬片置于倒置顯微鏡工作臺上的1 mL的灌流槽中,以95%O2與CO2混合氣體飽和的細胞外液室溫下灌流,流速1～2 mL/min。于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無小泡及顆粒、橫紋清晰、無收縮的細胞,在25℃下進行實驗。采用標準細胞貼附式方法,形成高阻封接后,以脈沖負壓破膜。補償電極電容。在電流鉗模式下,以1.5倍的閾上去極化電流刺激引發(fā)動作電位,刺激間隔為1 s。連續(xù)刺激后,AP形狀較為穩(wěn)定,連續(xù)記錄10個AP,取疊加平均圖形,測量其動作電位復(fù)極 50%和 90%時間(APD50and APD90)及有效不應(yīng)期(ERP)。數(shù)據(jù)的采集及分析處理由Pulse Pulsefit軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 心房肌細胞培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)72 h,倒置相差顯微鏡觀察見心房肌細胞呈多種形態(tài),以梭狀、桿狀、三角形和不規(guī)則形態(tài)為主。多數(shù)細胞開始出現(xiàn)規(guī)律搏動。經(jīng)免疫細胞化學鑒定,90%以上的細胞Sarcomerie actin染色陽性,細胞純度符合實驗要求。

表1 快速起搏后心房肌細胞動作電位周期和有效不應(yīng)期的變化(n=6)

2.2 動作電位周期和有效不應(yīng)期的變化 快速電場起搏6 h后心房肌細胞的APD50和ERP較起搏前無顯著變化,APD90較起搏前顯著縮短(P＜0.05)?？焖匐妶銎鸩?2、24和 48 h后心房肌細胞的APD 和APD 均較起搏前顯著縮短(P＜0.05),ERP較起搏前無顯著變化。結(jié)果見表1。

3 討 論

目前對房顫的研究大多是在臨床心肌標本和房顫動物模型上進行,雖然取得了良好效果,但也存在一定的局限性,比如無法進行精確干預(yù)、影響因素眾多以及倫理學問題等。隨著心房肌細胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟與完善,原代培養(yǎng)的心房肌細胞可以作為心肌模型進行心臟疾病病理生理學研究。直接在心房肌細胞上進行研究的結(jié)果可靠,所以建立房顫的細胞模型有重大意義[2]。

房顫的發(fā)生和維持是一種復(fù)雜的病理生理過程,雖然近年來對房顫電重構(gòu)的離子通道改變進行了深入研究,但學術(shù)界仍然對一些現(xiàn)象和理論存在分歧。在目前的研究中,公認心房電重構(gòu)在房顫的發(fā)生發(fā)展和維持中具有重要的作用。心房電重構(gòu)的概念由Wijffels等[3]在1995年提出,指在AF或快速心房率的影響下引起心房肌發(fā)生電生理功能改變,并進而促使AF的發(fā)生和維持(心房顫動誘發(fā)心房顫動)。心房電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房肌有效不應(yīng)期和動作電位時程呈進行性縮短,傳導(dǎo)速度減慢,心房肌不應(yīng)期離散度增加,以及頻率適應(yīng)性減退等。AF時引起的心房電重構(gòu)主要與心房肌細胞離子通道、縫隙連接蛋白和腎素、血管緊張素系統(tǒng)的改變有關(guān)[4-7]。

本研究利用原代培養(yǎng)的心房肌細胞建立了快速起搏的房顫細胞模型,對快速起搏后的電生理改變進行了初步的研究。結(jié)果表明:在快速起搏的 12、24和48 h,心房肌細胞的動作電位周期均較起搏前顯著縮短,提示心房肌細胞發(fā)生了電生理變化,與臨床研究和動物實驗取得的結(jié)果類似,有效不應(yīng)期無顯著變化,可能與起搏時間受限有關(guān)。分析其電生理變化發(fā)生的原因,可能與 L一型鈣通道[8-9]、鉀通道KV4.3等離子通道[10-11]和縫隙連接蛋白[12-13]等的表達改變有關(guān)[8],在房顫的電重構(gòu)過程中,早期主要是由于離子通道自身功能性的反饋調(diào)節(jié)引起動作電位周期和有效不應(yīng)期的縮短,后期則通過一系列信號傳導(dǎo)引起L一型鈣通道、鉀通道KV4.3等離子通道基因轉(zhuǎn)錄和表達下調(diào),導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的改變,最終成為維持動作電位周期和有效不應(yīng)期縮短的物質(zhì)基礎(chǔ)[14-15]。然而房顫的離子通道基因表達調(diào)控機制仍不明確,尚需要進一步的深入研究。

綜上所述,快速電場起搏的原代房肌細胞,電生理改變符合房顫電重構(gòu)的特點,因此可作為較為理想的房顫實驗研究模型,利用原代培養(yǎng)的心房肌細胞(心房肌細胞或心室肌細胞)建立快速起搏模型,可以得到與快速起搏動物模型相似的效果,但細胞模型更利于進行電生理研究以及進行更精確的藥物干預(yù)和分子生物學操作,為房顫的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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