馮利娟, 楊永弘, 俞桑潔, 姚開虎, 袁 林, 沈敘莊

A族β溶血性鏈球菌(Group A streptococcus,GAS)是引起兒童感染性疾病的重要病原菌。最多見的是急性咽扁桃體炎、猩紅熱和膿皰瘡等感染,嚴(yán)重感染有菌血癥、關(guān)節(jié)炎、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎等。有資料表明,由 prtF基因編碼的纖維結(jié)合蛋白F(fibronectin binding protein F)與菌株的emm分型、所導(dǎo)致疾病、對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥及耐藥基因相關(guān)[1],在我國尚缺少這方面的研究。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)兒科高水平大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的GAS感染株流行,分離株emm分型主要集中在emm12型和emm1型,本研究觀察prtF基因在我國GAS菌株所致疾病、emm分型以及與對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的關(guān)系。

材料與方法

一 、材料

(一)菌株來源 收集北京兒童醫(yī)院、重慶兒童醫(yī)院、深圳兒童醫(yī)院239株臨床分離株,其中取自侵襲性感染菌株 8株(3.35%),猩紅熱 84株(35.15%),咽扁桃體炎79株(33.05%),皮膚軟組織感染11株(4.60%),肺炎2株(0.84%),其他7株(2.93%),正常健康兒童48株(33.05%)。分離株的91.63%來自于咽拭子,5.02%來自感染黏膜或創(chuàng)面與皮膚軟組織感染不對應(yīng),2.09%來自血液,0.91%來自胸水。標(biāo)本接種于5%羊血培養(yǎng)基,挑選β溶血菌落進(jìn)行桿菌肽檢測,陽性株采用Lancefield族特異性抗血清分型確定為GAS。侵襲株是Working Group on Severe Streptococcal Infections定義的通常分離自無菌部位如血液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔、心包或腹膜、骨、深組織等部位[2]。本研究中病原菌株是指與健康攜帶株所對應(yīng)的致咽炎、猩紅熱、侵襲性感染等疾病的菌株。

(二)抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品 紅霉素(14元環(huán))、克拉霉素(14元環(huán))、阿奇霉素(15元環(huán))、交沙霉素(16元環(huán))和克林霉素均購自中國藥品生物制品檢定所。

(三)Taq酶、dNTP 購自寶生物工程有限公司;PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物序列見表1。

(四)質(zhì)控菌株 肺炎鏈球菌ATCC49619用作瓊脂稀釋試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

二、方法

(一)抗生素藥物敏感性試驗(yàn) 5種抗生素(紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素和克林霉素)對239株GAS的MIC值檢測采用瓊脂稀釋法,按CLSI規(guī)程操作[3]。抗菌藥敏感性判定依據(jù)2008年CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌多點(diǎn)接種器蘸取0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腉AS懸濁液接種于5%羊血的MH培養(yǎng)基上(Mueller-Hinton瓊脂+5%羊血的培養(yǎng)基)。質(zhì)控株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

(二)基因檢測 用PCR方法檢測編碼纖維結(jié)合蛋白基因prfF1、prtF2及編碼M蛋白的emm基因、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因ermB、ermTR和mef A。

PCR條件：94℃預(yù)變性1 min后,94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色成像。

表1 用于檢測 ermB、ermTR、mef A、prfF1、prtF2的引物Table 1.Primers used for amplification of ermB,ermTR,mef A,prfF1,and prtF2genes

(三)Emm分型 將PCR所得emm基因測序,測序序列與美國CDC數(shù)據(jù)庫對比(CDC：http：//www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocols.html)。

(四)統(tǒng)計(jì)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、prtF基因的攜帶率及在不同感染人群中的分布

在239株中,prf F1陽性 161株,占67.36%,prtF2陽性的有158株,占66.11%。兩個(gè)基因都為陽性的有141株,占59.00%,兩者均為陰性的有61株,占27.32%。

prtF1基因陽性菌株在致咽炎菌株、致猩紅熱菌株、侵襲性菌株、健康攜帶菌株中的攜帶率分別為69.62%、61.90%、37.50%和 81.25%;致咽炎、致猩紅熱菌株與健康攜帶菌株之間沒有差別(P＞0.05),僅健康攜帶菌株與侵襲性菌株之間有差別,健康兒童prtF1基因攜帶率高于侵襲性感染分離株(P＜0.05)。prtF2基因陽性菌株在致咽炎菌株、致猩紅熱菌株、侵襲性菌株、健康攜帶菌株中的攜帶率分別為 63.29%、59.52%、62.50%和83.33%。病原菌株與正常攜帶株比較,健康兒童prtF2基因攜帶率高于病原菌株(P＜0.05)(表2)。

prtF1及prtF2同時(shí)陽性攜帶率在致咽炎、猩紅熱和侵襲性疾病菌株中分別為56.96%、55.95%和37.50%,分布差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在健康攜帶株中占79.17%,在病原菌株中均低于健康攜帶菌株(P＜0.05)。

二、prtF基因在不同emm分型GAS中的分布

239株GAS分離株有16種emm分型,包括emm12、emm1、emm22 、emm4、emm3、emmst1815、emm18、emm6、emm77、emm87、emm80、emm86、emm41、emm63、emm112、emmstG485.0。其中最多的有 emm12(53.14%)、emm1(25.94%)、emm22(6.28%)、emm4(3.35%),這4種emm 分型占菌株總數(shù)的 88.7%。如表3所示：emm1、emm4中prtF1和prtF2的攜帶率及兩種基因同時(shí)攜帶率均低于emm12型和emm22型(P＜0.05)。兩者基因同時(shí)陽性在emm12、emm22型中更為多見,而在emm1型中則多為陰性。在 emm3、emmst1815、emm18型中多為僅prtF2陽性。

表2 prtF基因在不同感染人群中的分布Table 2.The prevalence of prtF genes by different infections

表3 纖維結(jié)合蛋白基因在不同emm型菌株中的分布Table 3.The distribution of prtF genes by different emm types

表4 纖維結(jié)合蛋白基因與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥及耐藥基因的關(guān)系Table 4.Relationship between prtF genes and macrolide resistance determinants

三、prtF基因與菌株耐藥性及耐藥基因的相關(guān)性

瓊脂稀釋法檢測239株GAS對4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及克林霉素的敏感性。結(jié)果共有42株紅霉素敏感株,197株紅霉素耐藥株。在197株耐藥株中,prtF1和 prtF2同時(shí)陽性在耐藥株中為64.46%,在敏感株中為30.95%,在耐藥株中的陽性率高于敏感株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。prtF1基因和prtF2基因單獨(dú)陽性在耐藥株分別為69.04%和 67.51%;在敏感株分別為57.14%和54.76%,兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

在197株大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株中ermB陽性的有186株,ermTR陽性的有11株,prtF1基因在ermB陽性的菌株中攜帶率為71.51%,在ermTR中的攜帶率為27.27%;prtF2基因在ermB陽性的菌株中攜帶率為 70.43%,在 ermTR中的攜帶率為18.18%,兩者同時(shí)陽性在攜帶ermB的菌株中占67.74%,prtF1,2基因同時(shí)陽性率在ermB陽性的菌株中高于ermTR陽性菌株(P＜0.05)。

討 論

纖維結(jié)合蛋白是存在于許多病原菌包括GAS中的重要毒力因子,有結(jié)合細(xì)胞外蛋白的能力,支持細(xì)菌黏附定植在黏膜表面并在黏膜表面或上皮細(xì)胞內(nèi)存活[8],并可以幫助細(xì)菌逃避機(jī)體免疫反應(yīng)。β內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素多在細(xì)胞外起作用,對進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌沒有效果,這也是許多青霉素治療GAS感染失敗的原因所在[1]。而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)殺滅細(xì)菌,國外有報(bào)道由erm基因介導(dǎo)的耐藥基因與prtF基因密切相關(guān)[4]。本研究則是觀察 prtF基因在我國GAS菌株所致疾病、emm分型以及與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的關(guān)系。

GAS菌株prtF基因的攜帶率在不同國家的研究中各有不同,一般為30%～40%到70%～80%[4,9],澳大利亞Vlaminckx等[10]報(bào)道,導(dǎo)致侵襲性感染的GASprtF1攜帶率為50%;而歐洲報(bào)道侵襲性分離株 prtF1的陽性率為19.41%[1],德國報(bào)道兒科臨床分離株陽性率30.56%[11],日本報(bào)道兒科臨床分離株陽性率為75.00%[12];PrtF2在國外報(bào)道的臨床分離株的攜帶率為36%～80%[13-14],prtF1/prtF2同為陽性率為31%～100%[13-14]。本文報(bào)道的菌株中prtF1的陽性率為70.24%,PrtF2的攜帶率為69.27%,prtF1/prtF2同時(shí)陽性率為65.37%,與日本相近。

有研究顯示,prtF1在侵襲性菌株比非侵襲性菌株中陽性率高[7],prtF1與 prtF2在非侵襲性菌株與健康攜帶株之間的陽性率沒有差別[7],而本結(jié)果顯示prtF1基因的攜帶率在致咽炎、猩紅熱株與非致病株之間沒有差別,與國外研究相似,但在正常攜帶株中prtF1的攜帶率高于侵襲株,在侵襲株與致咽炎、猩紅熱株中則沒有差別,這種結(jié)果可能是我們搜集到的侵襲株太少所引起的誤差所致。prtF2和 prtF1/prtF2基因組合在健康攜帶株中的陽性率高于病原株,與意大利報(bào)道的一致[1],而與澳大利亞報(bào)道的僅存在于病原菌株不同。有報(bào)道稱prtF2比prtF1更具有細(xì)胞內(nèi)攝作用,但是在我國更多地存在于健康兒童所攜帶的GAS中,prtF蛋白的作用機(jī)制與致病機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

同時(shí)攜帶prtF1和prtF2基因組的研究顯示,prtF1和prtF2或存在于一個(gè)潛在的致病島(纖維結(jié)合膠原束T移植抗原島)(M12型),或存在于獨(dú)立的基因座(M3型和M18型)[15]。有研究發(fā)現(xiàn),prtF1/prtF2基因組合通常存在于某些特定emm分型中,如emm3和emm12型,而emm18型菌株中不攜帶prtF基因,并與菌株的分離部位無關(guān)[7]。在本研究中,prtF更多的存在于emm12和emm22型中,6株emm18型菌株中多為 prtF2陽性,而emm3、emmst1815型中也只檢測到 prtF2基因。prtF基因與emm基因的關(guān)系尚需要進(jìn)一步的研究。由于本研究的菌株91.63%來自于咽拭子,其他來源的菌株較少,我們沒有分析不同分離部位之間的差異。

國外的報(bào)道顯示prtF基因在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥菌株中陽性率高,prtF在erm基因陽性的菌株中比mef A陽性菌株中更常見[2],prtF1/prtF2基因組合與erm基因的關(guān)系比單獨(dú)prtF關(guān)系更強(qiáng)[7]。德國關(guān)于兒科分離株的研究中在ermTR陽性菌中沒有檢測到prtF基因[13]。本研究的菌株中,prtF1和 prtF2在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感株和耐藥株中的攜帶率無明顯差異,這一結(jié)果與其他研究中這2種基因在耐藥菌株中攜帶率高的結(jié)果不符。本研究結(jié)果顯示 prtF1和 prtF2同時(shí)攜帶率在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感株和耐藥株中有差異,這與國外一些報(bào)道相同[7]。本研究還顯示這兩種纖維結(jié)合蛋白基因在ermB的菌株中攜帶率較高,ermTR陽性的菌株中僅有27.27%攜帶prtF1,與德國的結(jié)果類似。

GAS由于prtF蛋白的作用,易進(jìn)入上呼吸道上皮細(xì)胞逃避β內(nèi)酰胺類抗生素作用,又?jǐn)y帶erm基因而得以逃避大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作用。本研究表明,在我國兒童GAS分離株中,以共同攜帶prtF1/prtF2基因的emm12型菌株為主,多存在于健康兒童中,erm基因菌株多存在于咽部分離的非侵襲性菌株中,為耐藥菌株的傳播提供便利。這可能是我國的GAS耐藥水平高,而侵襲性不高的原因。我們結(jié)果補(bǔ)充了GAS臨床感染菌株關(guān)于prtF毒力基因的特征,從而對我國兒科GAS的致病性,耐藥性及其傳播,有了更深刻的認(rèn)識和理解,對制定治療措施提出新的要求。

致謝 本研究所用菌株由北京兒童醫(yī)院、重慶兒童醫(yī)院、深圳兒童醫(yī)院提供,mef A陽性對照菌株由中國藥品生物制品檢定所提供,在此表示感謝。感謝北京兒童醫(yī)院兒科研究所微生物室全體人員在研究過程中給予的幫助與支持。

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