龐杏林, 陳守義, 鄧志愛(ài), 張欣強(qiáng), 李孝權(quán), 胡玉山

銅綠假單胞菌(Pseudomonas areuginosa,Pa)是臨床上最常見(jiàn)的一種引起醫(yī)院感染的條件致病菌,由Pa引起的醫(yī)院感染發(fā)生率＞30%[1]。Pa對(duì)多種抗生素往往存在天然耐藥性,由該菌引起的醫(yī)院感染的流行已受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)隨著細(xì)菌分子分型方法的發(fā)展,監(jiān)測(cè)和控制醫(yī)院感染的水平有了很大的提高,脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)就是其中的一種細(xì)菌分子分型技術(shù),PFGE被認(rèn)為是目前細(xì)菌分子流行病學(xué)研究“金標(biāo)準(zhǔn)”,是公認(rèn)的醫(yī)院感染調(diào)查最好的分型方法[2]。本研究對(duì)ICU中分離的14株P(guān)a菌株進(jìn)行PFGE分型及耐藥性分析,以確定Pa菌株的克隆構(gòu)成,了解ICU中Pa感染的分子流行病學(xué)特征。

材料與方法

一 、材料

(一)實(shí)驗(yàn)菌株 14株P(guān)a分離自 2008年5—6月廣州市某三級(jí)甲等醫(yī)院ICU,臨床診斷為醫(yī)院獲得性肺炎患者的下呼吸道標(biāo)本[3]。標(biāo)準(zhǔn)菌株為Pa ATCC27853。

(二)主要試劑與儀器 培養(yǎng)基為廣州迪景公司商品,采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀、VIT EK GNI細(xì)菌鑒定卡和英國(guó)OXOID公司10種藥敏紙片。SPeI酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品,蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品,脈沖場(chǎng)電泳儀及Gel Dos XR成像系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

二 、方法

(一)細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行。采用VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀作細(xì)菌鑒定,10種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法),以Pa ATCC27853作質(zhì)控株。以CLSI M100-S17版的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果[4]。

(二)PFGE 將Pa菌株均勻洗脫于 200 μ L細(xì)胞懸浮液中,菌液濃度調(diào)為1.0麥?zhǔn)蠁挝?用蛋白酶K進(jìn)行消化,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠包埋消化過(guò)的Pa,倒入模具制成膠塊,切取4 mm×4 mm大小的膠塊加入限制性?xún)?nèi)切酶SPe I 30 u,在37℃水浴中酶切過(guò)夜。酶切膠塊進(jìn)行1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳,電泳參數(shù)為電壓6 V/cm,夾角120°,溫度14 ℃,第1階段脈沖時(shí)間5～15 s,電泳時(shí)間9 h,第2階段脈沖時(shí)間15～50 s,電泳時(shí)間9 h。用沙門(mén)菌H9812作為分子量對(duì)照。電泳完畢后膠塊用1 mg/L的EB染液染色30 min,超純水漂洗2次,每次 20 min。膠塊置成像儀閱讀結(jié)果,使用BioNumerics version 4.0軟件,選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法進(jìn)行PFGE結(jié)果處理和聚類(lèi)分析。

結(jié) 果

一、PFGE分型結(jié)果

14株P(guān)a菌株P(guān)FGE指紋圖見(jiàn)圖1,Pa菌株的全基因組DNA經(jīng)過(guò)SPe I酶切后,通過(guò)PFGE分析產(chǎn)生18～27個(gè)條帶,條帶分子量大小范圍20～1 200 kb。14株P(guān)a菌株P(guān)FGE電泳聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2,PFGE電泳條帶相似度在76%～100%,根據(jù)相似度100%者視為同型株,可將14株P(guān)a分6個(gè)型別,命名為A 、B、C、D 、E 和F型 。其中 A 型為優(yōu)勢(shì)菌株共8株(57.1%),B型2株(14.3%),其余型別各有1株(分別占7.1%)。

二、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

14株P(guān)a藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。Pa對(duì)10種抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥性。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)分子A型Pa可產(chǎn)生2種耐藥表型,有5株A型Pa產(chǎn)生相同的耐藥表型,對(duì)10種抗菌藥物100%耐藥,其余3株A型Pa對(duì)頭孢他啶、阿米卡星和氨曲南3種抗生素敏感,對(duì)其他7種抗菌藥物耐藥。2株B型Pa中除了1株對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥外,其余均為敏感。C型Pa對(duì)環(huán)丙沙星耐藥,D型和E型Pa對(duì)妥布霉素耐藥,F型Pa對(duì)10種抗菌藥物均敏感。患者平均住院時(shí)間為67 d,平均年齡74歲,基礎(chǔ)疾病為慢性阻塞性肺疾病(COPD),治療期間接受過(guò)氣管插管或呼吸機(jī)人工通氣及電動(dòng)吸痰等有創(chuàng)性治療措施,有激素治療史,而且均有第三代或第四代頭孢菌素及亞胺培南等抗生素用藥史。Pa耐藥表型與臨床資料見(jiàn)表2。

表1 14株P(guān)a的藥敏結(jié)果Table 1.Susceptibility of 14 Pseudomonas aeruginosa strains to antimicrobial agents

表2 14株銅綠假單胞菌耐藥表型與臨床資料Table2.Baseline clinical data and susceptibility of 14 Pseudomonasaeruginosa strains to antimicrobial agents

討 論

Pa廣泛存在于自然界,可定植于人體的皮膚、呼吸道、腸道和尿道,是一種重要的條件致病菌,對(duì)多種抗生素天然耐藥。隨著抗生素廣泛使用,Pa已成為醫(yī)院獲得性肺炎最常見(jiàn)的病原菌。來(lái)自國(guó)內(nèi)外的研究均顯示：Pa是醫(yī)院獲得性感染的最主要的病原菌之一[5-6]。在ICU中Pa的感染容易以暴發(fā)形式發(fā)生,暴發(fā)流行往往是由同一克隆株,通過(guò)某種傳播途徑,在同一病區(qū)內(nèi)引起不同患者的交叉感染。本次研究在ICU臨床分離的14株P(guān)a菌株中有8株同為PFGE分型A型菌株,具同源性,應(yīng)視為暴發(fā)流行株。分析結(jié)果表明在相近的時(shí)間段內(nèi),曾經(jīng)存在著某種途徑引起該菌株在ICU患者之間的克隆傳播。追溯病史可以發(fā)現(xiàn)患者平均住院時(shí)間為67 d,平均年齡74歲,均存在較嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病以及各種合并癥,治療期間都接受過(guò)氣管插管、呼吸機(jī)人工通氣及電動(dòng)吸痰等有創(chuàng)傷性治療措施,有激素治療史,而且均有第三代或第四代頭孢菌素及亞胺培南等抗生素用藥史。說(shuō)明ICU中容易發(fā)生Pa引起的醫(yī)院感染是與老齡患者、住院周期長(zhǎng)、免疫功能低下、大量抗生素使用和激素治療、使用各種侵襲性操作等因素相關(guān)。宿主防御能力受損的重癥患者罹患Pa感染的危險(xiǎn)較大。

本研究資料顯示,Pa對(duì)常用于治療產(chǎn)ESBLs菌感染的亞胺培南 35.7%耐藥,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]。亞胺培南屬于碳青霉烯類(lèi)抗生素,由于該藥抗菌譜廣,對(duì)產(chǎn)ESBLs和AmpC的細(xì)菌具有良好的抗菌活性,而被認(rèn)為是治療多重耐藥細(xì)菌的理想藥物。但是,近年來(lái)亞胺培南在臨床上廣泛應(yīng)用,其耐藥率也逐年增加,Pa對(duì)亞胺培南耐藥性尤為明顯[7]。本研究14株P(guān)a中5株(35.7%)對(duì)亞胺培南耐藥。Pa對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥與產(chǎn)生IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β內(nèi)酰胺酶、GES-2型β內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白o(hù)prD2缺失相關(guān)[8]。其他機(jī)制尚有靶位結(jié)構(gòu)改變、生物膜的形成等[9]。加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥性檢測(cè)及耐藥機(jī)制的研究,指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用該類(lèi)抗生素,延緩其耐藥性的發(fā)展。阿米卡星也是臨床治療Pa使用的一線藥物,但資料顯示Pa對(duì)阿米卡星的耐藥率為35.7%,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可高達(dá)56%[10]。這也說(shuō)明,對(duì)于產(chǎn)酶和泛耐藥的Pa臨床應(yīng)該選用何種抗生素予以治療已是一大難題,而抗生素的規(guī)范使用是避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的首要原則。

國(guó)內(nèi)外至今沒(méi)有建立標(biāo)準(zhǔn)的Pa菌PFGE實(shí)驗(yàn)程序,本研究擬探索和優(yōu)化PFGE應(yīng)用于Pa分型的實(shí)驗(yàn)條件,建立本實(shí)驗(yàn)室的Pa菌PFGE實(shí)驗(yàn)程序。與文獻(xiàn)對(duì)比[11-12],發(fā)現(xiàn)一些不同之處,如在Pa最佳菌液濃度的調(diào)整上,分別用了3種菌液濃度：0.5、1.0和2.0麥?zhǔn)蠁挝?結(jié)果表明1.0麥?zhǔn)蠁挝坏木簼舛葧r(shí)DNA電泳條帶最佳,由此說(shuō)明,菌量的過(guò)多、過(guò)少都會(huì)影響電泳條帶的清晰度。限制性?xún)?nèi)切酶的選用在PFGE中是至關(guān)重要的,本研究中分別選用了Xba I和Spe I 2種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切,Spe I酶切條帶相對(duì)較多,酶切效果較理想。電泳時(shí)間上比較了16、18和20 h的電泳效果,16 h電泳時(shí)間過(guò)短,沒(méi)有充分分開(kāi)酶切條帶的電泳距離,可辨性低,而20 h電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng),小于50 kb的酶切片段電泳于凝膠外,18 h電泳時(shí)間既保留了所有DNA酶切片段又可以有效分辨DNA條帶的距離,所以確定18 h為最合適的電泳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明,本研究選擇的PFGE方法和條件是適宜的,具有較好的分型性、分辨力和重復(fù)性,是理想的細(xì)菌分型方法,能準(zhǔn)確地反映病原的流行病學(xué)相關(guān)性。

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