張廣峰，陳祥貴，帥培強，林 琳

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川出入境檢驗檢疫局，四川 成都 610041)

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記蛋白，常以融合蛋白的形式在哺乳動物細胞中表達，以觀察目標(biāo)蛋白在細胞中的移動和定位。

在很多研究中，需要對細胞進行固定以便進行后續(xù)的顯微觀察、探針雜交或免疫化學(xué)染色。但是細胞固定過程中，固定劑選擇不當(dāng)或者固定程序不合理可能導(dǎo)致GFP熒光強度顯著下降甚至熒光消失，從而不能觀察到GFP的分布、定位及相關(guān)的顯微結(jié)構(gòu)變化[1]。因此，探索不同細胞固定劑對GFP發(fā)光特性的影響，對指導(dǎo)相關(guān)的實驗研究具有一定的實際意義。

1 實驗

1.1 細胞

HepG2細胞(ATCC HB-8065TM)購于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院。HepG2細胞貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。一般2～3 d傳代1次。

1.2 細胞固定劑

95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、丙酮、Carnoy固定液(無水乙醇60 mL+氯仿30 mL+5%冰醋酸10 mL)、4%多聚甲醛(pH值7.4)。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 GFP在細胞中的表達

貼壁培養(yǎng)的HepG2細胞經(jīng)0.02%EDTA+0.25%胰酶消化后制備成單細胞懸液，鋪于96孔板上，每孔200 μL，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 d后，用表達GFP的腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為30，48 h后用熒光顯微鏡觀察細胞發(fā)光情況，當(dāng)細胞GFP陽性率達到80%以上時，用于實驗。以未經(jīng)腺病毒感染的細胞作為對照。

1.4 細胞固定

將發(fā)光細胞的培養(yǎng)液吸去，并用PBS洗滌2次，然后加入待試固定劑200 μL，按室溫、4℃分別固定5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，固定后將固定液吸出，然后用 PBS洗滌3次。倒置顯微鏡(Leica DMILHC)觀察固定后發(fā)光情況并拍照。

1.5 酶標(biāo)儀測發(fā)光值

經(jīng)不同固定劑固定的96孔板上細胞用熒光/化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(TECAN F200)測發(fā)光值(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm)。對比固定前后發(fā)光值，按下式計算GFP熒光保存百分率(F)：

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光顯微鏡觀察固定劑對細胞GFP發(fā)光的影響

HepG2細胞經(jīng)腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，48 h后80%以上細胞表達GFP。在感染復(fù)數(shù)為30時，細胞未見明顯病變。表達GFP的細胞用不同固定劑處理后，在顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同固定劑對細胞GFP發(fā)光的影響(室溫5 min)

由圖1可以看出，在室溫下，Carnoy固定液、甲醇、5%冰醋酸固定5 min后，細胞GFP熒光基本消失，95%乙醇固定導(dǎo)致GFP強度顯著降低，而丙酮和4%多聚甲醛固定30 min后仍然可觀察到足夠強的熒光。

2.2 酶標(biāo)儀檢測固定劑對細胞GFP發(fā)光的影響

細胞用不同固定劑進行固定，用熒光酶標(biāo)儀檢測細胞發(fā)光值，結(jié)果見圖2。

圖2 室溫(a)和4℃(b)固定后細胞GFP熒光保存百分率

由圖2可以看出，無論在室溫還是4℃進行固定，Carnoy固定液、95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸處理5 min就使得GFP發(fā)光值降低到25%及以下。而4%多聚甲醛和丙酮處理5 min對GFP發(fā)光無顯著影響；但是隨著處理時間的延長，GFP發(fā)光值逐漸降低；當(dāng)處理時間達到30 min時，4%多聚甲醛固定的細胞和丙酮4℃固定的細胞仍可保存大約40%的發(fā)光值。

2.3 討論

細胞和組織固定劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)不同的組織、細胞類型及不同的實驗?zāi)康倪M行選擇。甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛是生物醫(yī)學(xué)實驗中最常用的固定劑，冰醋酸和Carnoy固定液用于一些特定的細胞和組織切片。盡管GFP廣泛用于生物醫(yī)學(xué)的研究，但是對于組織細胞固定過程中GFP發(fā)光特性變化的研究報道很少，實驗人員只能從相關(guān)的文獻報道中收集零星的信息來作為指導(dǎo)。但遺憾的是，大多數(shù)文獻對細胞固定方法的描述非常簡單，使經(jīng)驗不豐富的實驗人員難以準(zhǔn)確把握。從已有的文獻報道來看，表達GFP的細胞的固定大多數(shù)采用多聚甲醛，能有效地保持GFP的發(fā)光特性，這與本實驗研究結(jié)果一致。但是，在實驗中發(fā)現(xiàn)，為了保持GFP的發(fā)光特性，配制多聚甲醛時必須將其pH值保持在中性，否則會導(dǎo)致GFP熒光消失。

本實驗研究結(jié)果表明：丙酮是保持GFP熒光特性的另一可選的細胞固定劑。在4℃用丙酮固定30 min后，細胞仍可保持足夠強的熒光。為了保證良好的固定效果，丙酮固定最好在低溫下進行。由于丙酮和多聚甲醛固定細胞機制不同，因此可為不同目的的實驗研究提供選擇。

有文獻報道甲醇固定可保持細胞內(nèi)GFP的發(fā)光特性[2]，但一般認為甲醇可能導(dǎo)致GFP發(fā)光強度的減弱[3]。李榮芳等[4]研究表明，甲醇固定會導(dǎo)致細胞在進行免疫組織化學(xué)過程中GFP熒光消失。本實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙醇在室溫或4℃時固定細胞均會導(dǎo)致GFP熒光的迅速消失，在較低的溫度下(如-20℃)用甲醇或者乙醇固定細胞可部分保留GFP的熒光特性，國外也有文獻報道將甲醇、乙醇單獨或者與丙酮、甲醛混合作為細胞固定劑，但除非特定的實驗需要，建議采用多聚甲醛或丙酮固定細胞以保持GFP熒光特性。

3 結(jié)論

采用6種細胞固定劑分別在室溫和4℃條件下對表達GFP的HepG2細胞進行固定，并對其發(fā)光特性進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在室溫還是在4℃條件下，95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、Carnoy固定液固定細胞后綠色熒光迅速消失，而丙酮和4%多聚甲醛固定細胞后仍可保持足夠強的綠色熒光，但保留的熒光強度隨固定劑作用時間的延長和作用溫度的升高而降低。因此，對表達GFP細胞進行固定時，宜選擇丙酮和4%多聚甲醇作為固定劑，并降低作用溫度和縮短作用時間，有利于保持細胞的綠色熒光。

[1] Mans Ehrenberg，羅文新，夏寧邵(譯).綠色熒光蛋白——發(fā)現(xiàn)、表達和發(fā)展[J].生物物理學(xué)報，2008，24(6)：422-429.

[2] Girotti M，Banting G. TGN38-green fluorescent protein hybrid proteins expressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time，invivostudy of membrane traffic pathways and suggest a possible role for ratTGN38[J].Journal of Cell Science，1996，109(12)：2915-2926.

[3] Carraway Kermit L，Carraway Coralie A Carothers. Cytoskeleton： Signalling and Cell Regulation： A Practical Approach[M].Oxford:Oxford University Press，2000：114.

[4] 李榮芳，袁慧，劉定干.甲醇固定導(dǎo)致綠色熒光蛋白的熒光消失[J].細胞生物學(xué)雜志，2007，29(2)： 303-304.